Светопольная микроскопия.
Устройство биологического микроскопа
и техника микроскопирования.
Устройство светового биологического микроскопа .
Все световые биологические микроскопы отечественного производства условно можно разделить на три группы: микроскопы биологические упрощенные, микроскопы биологические рабочие, микроскопы биологические исследовательские. Они предназначены для исследования препаратов в проходящем свете в светлом поле.
Принципиальное устройство биологических микроскопов практически одинаково.
В настоящем руководстве производится описание устройства и правил работы с биологическим микроскопом типа «Биомед».
Микроскоп (от греческого слова micros – малый, scopeo – смотрю) – это оптический прибор (рис.1) состоящий из трёх основных частей: механичес-кой, оптической и осветительной.
Механическая часть и осветитель . Нижняя часть штатива массивная и служит опорой микроскопа. Источником освещения света служит электрическая лампочка, вмонтированная в основание микроскопа. На боковой панели основания расположены выключатель осветителя (2) и регулятор освещения препарата (17). На штативе укреплен крестообразный столик, благодаря которому с помощью винтов препаратоводителя препараты могут перемещаться в двух взаимно перпендикулярных направлениях. Тубусодержатель (11) связан с основанием микроскопа неподвижно. Фокусировка препарата осуществляется с помощью макромет ри ческого (14) и микрометрического (15) винтов.
Макрометрический винт служит для грубой настройки микроскопа. Для точной фокусировки пользуются микровинтом .
Правило работы с микровинтом . Полных оборотов микровинтом делать нельзя. Вначале необходима грубая настройка. Разрешается поворачивать микровинт в ту или иную сторону не более 2…4х делений (не более пол-оборота).
Отличительной особенностью микроскопа БИОМЕД - 4 , которым оснащены наши микробиологические лаборатории, является его оснащенность бинокулярной насадкой, отсутствием адаптера видео/фотонасадки (10), а также переключателя светового потока (12).
В верхнюю часть тубусодержателя вставляется вместо тринокулярной бинокулярная насадка (11) с окулярами. На тубусодержателе укреплен револьвер с объективами(8).
Рис.1 Общий вид микроскопа БИОМЕД-1:
1 – подложка основания; 2 - основание микроскопа с выключателем; 3 –осветитель; 4 – конденсор Аббе; 5 – предметный столик с измерительным нониусом; 6 – держатель препарата; 7 – объективы; 8 – револьверная головка; 9 – окуляры; 10 – адаптер видео/фотонасадки; 11 – тринокулярная насадка; 12 – переключатель светового потока; 13 – штатив; 14 –макрометрический винт; 15 – микрометический винт; 16 – коаксиальная ручка перемещения препарата; 17 – регулятор яркости осветителя.
Оптическая часть микроскопа состоит из конденсора системы Аббе с ирисовой диафрагмой, объективов и окуляров. Рукояткой (4) можно регулировать объем лучей света, падающих на препарат, за счет изменения открытого отверстия диафрагмы. Окрашенные препараты лучше рассматривать при почти полностью открытой диафрагме, неокрашенные - при уменьшенном отверстии диафрагмы. Конденсор (от лат. condenso - уплотняю, сгущаю) собирает лучи, идущие от источника через диафрагму, и направляет их наобъект. С помощью винта конденсора (4), опуская его или поднимая, регулируют степень освещения препарата.
Правило работы с конденсором. При работе с большими увеличениями микроскопа конденсор должен находиться в верхнем положении. При работе с малыми увеличениями микроскопа конденсор опускают вниз.
Объектив (греч. objectum – предмет исследования)представляет собой наиболее важную часть микроскопа. Это многолинзовая короткофокусная система, от качества которой зависит в основном изображение объекта. Наружная линза, обращенная плоской стороной к препарату, носит название фронтальной, она обеспечивает увеличение. Увеличение объектива всегда обозначено на его оправе. Микроскоп БИОМЕД – 4 оснащен объективами, увеличивающими в 4, 10, и 40 (сухие) и 100 (иммерсионный) раз.
От кривизны фронтальной линзы объектива зависит его фокусное расстояние и увеличение. Чем больше кривизна фронтальной линзы, тем короче фокусное расстояние и тем больше увеличение объектива. Это необходимо помнить при микроскопировании – чем большее увеличение дает объектив, тем меньше свободное рабочее расстояние и тем ниже следует опускать его над плоскостью препарата (табл.1).
Таблица 1. Оптические данные объективов микроскопа «Биомед-4»
Остальные линзы в системе объектива выполняют преимущественно функции коррекции оптических недостатков, возникающих при исследова-нии объектов. Как известно, изображение, получаемое при помощи линз, обладает рядом недостатков – аберраций . Наиболее существенные – сферическая и хроматическая аберрации . Первая проявляется в невозможности одновременной фокусировки всего поля зрения, вторая связана с разложением белого света на спектр, в результате чего изображение преобретает радужную окраску. Объективы, у которых сферическая и хроматическая аберрации скоррегированы не полностью, называются ахроматами . Они содержат до шести линз и дают изображение наиболее резкое в центре. Края поля зрения при использовании ахроматов бывают окрашены в разные цвета спектра. Ахроматы широко распространены вследствие своей простоты и дешевизны.
Более совершенные объективы – апохроматы . Хроматическая погрешность в них почти в 10 раз меньше, чем у ахроматов. Апохроматы обеспечивают более равномерную резкость изображения. На их оправе имеется обозначение «Апохр». Полностью устраняют искривление поля зрения планахроматы . Эти объективы применяют главным образом при микрофотографировании.
Кроме того, объективы делятся на сухие и иммерсионные. Сухими называются объективы, при работе с которыми между фронтальной линзой и рассматриваемым предметом находится воздух. Вследствие того, что лучи света проходят среды с различными показателями преломления (покровное стекло и воздух), часть их отклоняется и не попадает в объектив. Иммерсионными (от лат. immersion – погружаю) называются объективы, фронтальная линза которых при работе погружается в нанесенную на препарат каплю жидкости с показателем преломления, близким к показателю преломления стекла.
Окуляр (от лат. oculus – глаз) состоит из двух линз –- глазной (верхней) и собирательной (нижней). Окуляр служит для рассмотрения изображения предмета, даваемого объективом. Увеличение объективов указано на их оправе. В комплект к микроскопам типа БИОМЕД-4входит объектив с увеличением 10х.
Микроскоп БИОМЕД-4снабжен бинокулярной насадкой, которая имеет собственное увеличение (около 1,5х) и снабжена коррекционными линзами. Бинокулярной насадкой следует пользоваться при длительной работе с микроскопом. Корпус насадки может раздвигаться в пределах 55…75 мм в зависимости от расстояния между глазами наблюдателя. Работа с бинокулярной насадкой улучшает видимость объекта, снижает яркость изображения и тем самым сохраняет зрение.
1 | | | |
Последняя четверть XIX столетия ознаменовалась углублением исследований строения тканей и клеток, что сделалось возможным вследствие успехов, достигнутых в усовершенствовании микроскопа и особенно в разработке тех приемов микроскопического исследования, какими мы пользуемся и в настоящее время.
Высокие и неуклюжие, на наш взгляд, микроскопы первой половины XIX в. во второй его половине принимают более практичные формы. Укорачивается тубус, устанавливается стандартная высота предметного столика. Штатив становится более массивным и устойчивым, ножка его, которой ранее придавалась круглая форма или вид треножника, теперь устраивается чаще всего в виде подковы, что дает лучшую устойчивость. Отверстие предметного столика снабжается диафрагмами в виде сменяющихся цилиндров или круга с отверстиями разного диаметра, вращающегося под предметным столиком. Все микроскопы снабжаются микрометрическим винтом, а большие штативы, кроме того, кремальерой.
Окуляры начинают изготовлять более светосильными, причем обращается внимание на выпрямление поля зрения. Особенные улучшения были достигнуты в конструкции объективов. Уже в первой половине XIX в. некоторые фирмы изготовляли объективы, дававшие с сильными окулярами увеличение более чем в 1000 раз. Но практическое применение таких сильных систем было ограничено тем, что поле зрения становилось темным, так как при малом фокусном расстоянии значительное количество лучей, преломляясь в воздухе, отклонялось и не попадало в объектив. Коренное улучшение было достигнуто введением иммерсионных объективов.
Принцип иммерсии, т. е. погружения объектива в жидкую среду, помещенную между объектом и фронтальной линзой, предложил в 1850 г. Дж. Амичи. Вначале он употреблял для иммерсии растительное масло, но отличия в показателе преломления заставили заменить масло водой. Хотя вода также отличалась по показателю преломления от стекла, все же водная иммерсия была известным достижением и для некоторых специальных целей употребляется и в наше время.
Во второй половине прошлого века появилось большое число оптических фирм, изготовлявших микроскопы. Кроме уже ранее получившей известность фирмы Шевалье, продолжает работу оптический институт Оберхейсера; из Франции он был переведен в Германию и в Потсдаме продолжал деятельность под фирмой Гартнака (Hartnack). В 1859 г. эта фирма внесла в конструкцию иммерсионных объективов некоторые улучшения, и в 60-х и 70-х годах микроскопы Гартнака считались одними из лучших. Продолжала деятельность фирма Шик в Берлине. Бывший институт Фраунгофера под фирмой Мерц (G. und С. Merz) изготовлял большие штативы с многими объективами и механическими приспособлениями. В 1849 г было организовано производство микроскопов в Ветцларе (Германия), позже получившее широкую известность под фирмой Лейтца (Ernst Leitz).
Прогресс в конструкции микроскопов во второй половине XIX в. неразрывно связан с немецкой оптической фирмой Цейсса, обязанной своими успехами выдающемуся физику Аббе.
В 1846 г. оптик Карл Цейсс (Cazl Zeiss, 1816-1888) основывает в Иене мастерскую, которую талант и выдающиеся способности Аббе превратили в оптический институт мирового значения. Личность Аббе представляет, помимо его научных заслуг, большой интерес. Сын ткацкого мастера в Эйзенахе, в детстве видевший нужду в семье, Эрнст Аббе (Ernst Abbe, 1840- 1905) уже мальчиком обнаружил исключительные способности, обратившие на него внимание учителей, настоявших на его дальнейшем образовании. По окончании университета Аббе занимает кафедру теоретической физики в Иене (1870), а позже становится директором Иенской обсерватории (1877-1890). По предложению Цейсса, состоявшего университетским механиком, Аббе принимает участие в работах организованных Цейссом оптических мастерских, становится совладельцем, а до смерти Цейсса владельцем фирмы. Однако Аббе отказался от прав владельца предприятия и, сохранив за собой руководство, передал доходы от предприятия в пользу рабочих и служащих Аббе разрабатывает математически теорию микроскопа, доведя до предела оптические возможности светового микроскопа. По его инициативе и под его руководством при заводе организован научный оптический институт, где разрабатывается система измерений, дающих научный критерий для оценки качеств микроскопа. Создаются новые сорта стекла (по инициативе Аббе создано известное производство «иенского стекла» Шотта); производство микроскопов становится на подлинно научное основание. Н. А. Умов (1846-1915), выдающийся русский физик, в проникновенной статье, посвященной памяти Аббе, писал: «Аббе заменил работу ощупью и наугад точным теоретическим вычислением наиболее выгодных форм оптических стекол, их кривизны и взаимных расстояний в связи с физическими свойствами стекол, из которых они должны быть изготовлены. Через несколько лет упорного труда микроскопы Цейсса, построенные по указаниям Аббе, превзошли по своим качествам все до того времени известные» (Н. А. Умов, 1905).
Первым крупным достижением оптического института Цейсса явилось изготовление масляного иммерсионного объектива, так называемой гомогенной иммерсии, основанной на применении кедрового масла. Этот объектив был рассчитан на применение в качестве иммерсионной среды кедрового масла и имел неоспоримое преимущество перед водной иммерсией Амичи. Масляный иммерсионный объектив был изготовлен впервые в 1878 г. по указанию Стефенсона (Stephenson) в Лондоне и под руководством Аббе. Это было крупнейшим достижением в технике микроскопии. Исследователь получил сильный объектив, который давал возможность применять большие увеличения, не ослабляя освещенности поля зрения. Масляная гомогенная иммерсия быстро завоевала признание и обусловила успехи цитологии в последней четверти прошлого века.
Применение масляной иммерсии требовало реконструкции системы освещения объекта. Еще в 1873 г. Аббе конструирует особый осветительный аппарат, позволяющий использовать все достоинства нового объектива. Этот «осветительный аппарат по Аббе» становится обязательной частью всякого исследовательского микроскопа.
По вычислениям Аббе фирма Цейсс выпустила в 1886 г. новые объективы-апохроматы, где коррекция сферической и хроматической аберрации доведена до предела. В комбинации с особыми компенсационными окулярами апохроматы явились последним словом оптической техники светового микроскопа. Как показали исследования Аббе, изготовлением апохроматов с высокой апертурой достигнут предел разрешающей способности линз микроскопа, поставленный длиной светового луча (в нашем веке этот предел возможностей микроскопического исследования преодолен изобретением электронного микроскопа). Аббе сконструировал также рисовальный аппарат, позволяющий производить точную зарисовку микроскопических объектов.
Достижения Аббе были использованы другими фирмами, получившими известность во вторую половину прошлого столетия. В Ветцларе в 1873 г. открыла производство фирма Зейберт (Seibert); ее микроскопы славились в конце прошлого столетия. Около 1872 г. в Гёттингене открывается оптический институт Винкеля (Winkel), изготовлявший превосходные инструменты и выпустивший флюоритные системы, более дешевые, чем апохроматы, но сохраняющие ряд свойственных им преимуществ. Нет надобности упоминать множество других оптических производств этого периода. Отметим только сыгравшую значительную роль в распространении микроскопа французскую фирму Нашэ (Nachet), микроскопы которой имели в прошлом веке значительное распространение, и австрийскую фирму Рейхерт (С. Reichert) в Вене, основанную в 1876 г., микроскопы которой при хорошем качестве подкупали относительной дешевизной. Несколько своеобразно развивалось производство микроскопов в Англии, где долгое время были распространены громоздкие штативы на треножниках, мало похожие на установившуюся на континенте форму микроскопа.
Обращено было внимание также и на конструкцию штатива микроскопа. Во второй половине прошлого столетия существенную лепту в этом отношении вложил А. И. Бабухин (1835-1891), крупный русский гистолог, основатель московской гистологической школы и одной из первых микробиологических лабораторий, в ходу был даже термин «бабухинский штатив». Прямая колонка микроскопов, характерная для конца прошлого столетия, в нашем столетии приобрела форму изогнутой ручки. Особенно резкие изменения приобрел штатив в последние десятилетия: тубус принял изогнутую форму, винты перенесены под предметный столик; в ряде моделей микроскоп монтируется вместе с лампой, микрофотографическим аппаратом и т. д.
Выдвинутое Брюкке предположение о сложности строения «элементарного организма» - клетки носило априорный характер; фактических данных для такого предположения тогда еще не было. Чтобы клетка в понимании биолога перестала быть простым комочком протоплазмы, нужны были более совершенные методы исследования, чем те способы микроскопического изучения тканей, какие применялись в первой половине прошлого столетия. Но постановка проблемы есть путь к ее решению. Потребность проникновения в тонкое строение клетки побуждала к поискам новых методов микроскопического исследования. Вся последняя четверть прошлого века проходит под знаком усовершенствования микроскопической техники, причем это касается как микроскопа и ряда вспомогательных приборов, так и методики подготовки объектов для изучения.
История микроскопической техники остается пока ненаписанной главой науки. В литературе встречаются лишь случайные и порой неточные справки, касающиеся отдельных деталей. Поэтому написание этой главы книги представило значительные трудности, и она содержит многочисленные пробелы.
Микроскоп, как бы он ни был усовершенствован, не дал бы возможности проникнуть в тонкие гистологические структуры, если бы параллельно с совершенствованием микроскопа не развивалась техника обработки материала, техника изготовления «микроскопического препарата». Микроскописты первой половины XIX в. изучали ткани либо в свежем состоянии, либо в состоянии начального посмертного изменения. Методы подготовки материала ограничивались расщипыванием или раздавливанием тканей и применением таких реактивов, как уксусная кислота, щелочи, йод и редко спирт. Постоянных препаратов в тот период не изготовляли, и это, конечно, очень затрудняло исследование.
Уже во второй четверти прошлого столетия начинаются поиски консервирующих жидкостей, в которых ткани можно было бы сохранить на препарате в течение продолжительного времени. Главным ингредиентом в таких жидкостях была сулема, применявшаяся в большом разведении. В 1839 г. Гудбай (Goodbay) предложил «универсальную консервирующую жидкость» для изготовления постоянных препаратов, содержавшую сулему, поваренную соль и квасцы. Поэтому образцу ряд других микроскопистов пытались создать варианты консервирующих сред для заключения объекта. Но консервирующее действие таких сред было плохим, и их нельзя ставить на один уровень с современными фиксаторами. Положительное их значение заключалось в том, что они выявили преимущество изучения тканей не в воздухе, а в жидкой среде, и поэтому, начиная с сороковых годов, делаются попытки найти удобные среды для заключения объекта. С другой стороны, эти жидкости имели и отрицательное значение. В то время как раньше изучались преимущественно свежие объекты, появление консервирующих жидкостей повело к тому, что исследователь, подвергнув ткань расщипыванию или раздавливанию, заключал ее в консервирующую среду и полагал, что он изготовил «постоянный препарат». В действительности же в этой жидкости ткани подвергались таким изменениям, что строение не сохранялось, и изучались искаженные остатки структуры.
Только в шестидесятых годах начали применяться более рациональные методы заключения объекта в жидкие среды. Удовлетворительным методом явилось заключение в глицерин, которое начали впервые применять в Англии. Наряду с глицерином применялись различные смеси: глицерин с желатиной, глицерин с гуммиарабиком. Эти среды давали несомненное преимущество перед водой и в шестидесятых годах имели широкое применение.
Канадский бальзам (обычная среда для заключения объекта в современной микротехнике) пробовали применять давно. Еще в 1832 г. его пытался использовать Бон (Bond), а в 1835 г, - Причард (J. С. Pritchard, 1786-1848). Но первые попытки применения канадского бальзама давали плохие результаты, так как объекты предварительно подвергались просушиванию. Впервые в 1851 г. английский невролог Кларк (Jacob A. L. Clarke, 1817-1880), изготовляя препараты мозга, попытался обойти высушивание и использовал обезвоживание препарата спиртом, а затем просветление его в скипидаре. Тем не менее еще в 1868 г. английский микроскопист Бил (L. S. В. Beal, 1828- 1906) в руководстве микротехники указывает, что при применении канадского бальзама объект должен быть высушен при высокой температуре. Метод Кларка также не давал хороших результатов, так как обезвоживание было недостаточным. В 1865 г. немецкий патологоанатом Риндфлейш (Rindfleisch, 1836-1908) предложил применять гвоздичное масло, а в 1863 г. русский гистолог К. З. Кучин (1834-1895), а позже дерптский анатом Л. X. Штида (1837-1918) применили креозот. Штида также ввел в употребление бергамотное масло. При плохом обезвоживании эти средства давали вначале недостаточные результаты (лучше других был креозот, допускающий меньшее обезвоживание). Только в семидесятых годах, когда научились производить достаточное обезвоживание объекта, канадский бальзам получает преимущество перед другими средами и находит широкое применение.
Однако основным недостатком старой техники изготовления постоянных препаратов было отсутствие фиксации. Методы фиксации возникли на основе методики уплотнения тканей. Для изготовления срезов из мягких тканей исследователи искали средства их уплотнения. Одним из первых уплотняющие жидкости начал применять Пуркине. В 40-50-х годах уплотнение тканей для изготовления разрезов становится общепринятым.
В 1840 г. датский анатом и патолог Ганновер (Adolph Н. Hannover, 1814-1894) помещает в «Мюллеровском архиве» статью о «хромовой кислоте, превосходном средстве для микроскопических исследований», и с этого времени хромовая кислота является одним из употребительнейших реактивов для уплотнения, а в дальнейшем - и фиксации животных тканей. Позже для этой цели начинает применяться двухромокислый калий. В поисках лучших средств для сохранения структуры тканей микроскописты пытаются составлять сложные фиксаторы, в состав которых входят различные ингредиенты. Г. Мюллер (Н. Muller, 1820-1864), профессор анатомии в Вюрцбурге, известный своими исследованиями по анатомии глаза, предложил в 1859 г. уплотняющую жидкость, из комбинации двухромокислого калия и сернокислого натрия, знаменитую «мюллеровскую жидкость», в течение многих лет являвшуюся распространенным гистологическим фиксатором. В конце 60-х годов французский гистолог Ранвье (Louis A. Ranvier, 1835-1922) предложил для уплотнения и фиксации пикриновую кислоту, которая нашла в дальнейшем широкое признание.
Значительный прогресс в фиксации тканей был достигнут применением для этой цели сулемы. В консервирующих жидкостях она употреблялась давно, но там ее концентрация была недостаточна для фиксации тканей. В качестве фиксатора сулема вошла в гистологическую технику лишь после 1878 г., когда швейцарский зоолог Ланг (Arnold Lang, 1855-1914) предложил применять ее в концентрированных растворах и в комбинации с уксусной кислотой. Для фиксации тонких гистологических структур сулему впервые употребил выдающийся немецкий физиолог Рудольф Гейденгайн (Rudolf Heidenhain, 1834-1897) в 1888 г. Ингредиенты для составления фиксаторов обогатились далее введением в гистологическую технику осмиевой кислоты (Макс Шульце, 1864), сохраняющей особенно хорошо липоидные структуры клетки. Применение осмиевой кислоты в качестве фиксатора в комбинации с другими реактивами широко вошло в обиход гистологической техники. Флеш (Max Flesch) в 1879 г. предложил комбинацию хромовой и осмиевой кислот, а в 1882 г. Флемминг, один из крупнейших гистологов конца прошлого века (с его именем мы встретимся дальше), предложил свою известную фиксирующую жидкость. Вплоть до 70-х годов микроскописты говорили не о фиксации, а о консервировании и уплотнении тканей. Термин «фиксация» и связанное с ним понятие входит в употребление только в начале 80-х годов. В состав флемминговской жидкости входили хромовая, осмиевая и уксусная кислоты; она долгое время считалась лучшим фиксатором для изучения тонкого строения клеток. Современные фиксирующие жидкости Шампи и Мевеса представляют собой ее модификацию. В 1894 г. К. Ценкер (К. Zenker) предложил свое видоизменение мюллеровской жидкости, добавив к ней сулему и уксусную кислоту. Эта ценкеровская жидкость и теперь остается одним из лучших и употребительнейших фиксаторов. В 1893 г. Блум (F. Blum) вводит в употребление формалин, получивший в дальнейшем широкое применение как фиксатор.
Таким образом, к 80-м годам гистология обогащается значительным арсеналом фиксаторов, сохраняющих структуру тканей; отходит на задний план изучение тканей в свежем состоянии; с каждым годом пополняется список реактивов, применяемых для фиксации гистологических объектов; множатся бесчисленные предложения о составе фиксирующих жидкостей и смесей, из которых только небольшое количество прочно вошло в микроскопическую практику.
В этом развитии микроскопической техники нельзя не отметить отрицательного момента. Во-первых, успехи методов фиксации привели к тому, что исследование свежего материала было заброшено; структуры фиксированной протоплазмы некритически воспринимались как прижизненные структуры, и на этой почве было немало увлечений и сделано немало ошибок. Сама методика фиксации развивалась эмпирически: исследователи, пробуя тот или другой фиксатор, часто не исходили из научных оснований, а бессистемно отыскивали практически пригодные реактивы.
Так как уже с XVIII в. начали применять для микроскопии проходящий свет, возникает необходимость соответствующей обработки объекта. Исследователи первой половины XIX в. пытались обойти эту трудность изучением тонких пленок или кусочков ткани, подвергнутых расщипыванию иглами или раздавливанию. Это грубо нарушало структуру тканей. По отношению к более плотным тканям для получения тонких прозрачных пластинок давно начали применять бритву. Мягкие ткани для приготовления из них срезов с помощью бритвы зажимали в мякоть ветки бузины или в уплотненную долгим пребыванием в хромовой кислоте печень. В середине прошлого столетия для изготовления срезов стали применять заливку в более плотные среды. В пятидесятых годах ботаник Фенцль (Eduard Fenzl) предложил для этой цели парафин в 1856 г. Бёттхер (А. В. Bottcher, 1831-1889), профессор в Дерпте, начал применять желатину. Вначале при заливании в парафин не получалось пропитывания объекта, и, естественно, такая заливка не давала хороших результатов. В конце 70-х годов начинают применять промежуточные среды: гвоздичное масло, креозот, бергамотное масло, ксилол; но только с введением заливки в термостатах (W. Giesbrecht, 1881) применение парафина дало хорошие результаты и вошло в постоянный обиход микроскопической техники. В 1879 г. французский гистолог Дюваль (Mathias Duval, 1844-1907) предложил новую среду для заливания объектов - коллодий. Немецкий гистолог Шиффердеккер (Paul Schiefferdecker, 1849-1931) заменил коллодий целлоидином, занявшим, наряду с парафином, прочное место в качестве среды для заливки объектов с целью получения тонких срезов.
Так как приготовление тонких срезов ручной бритвой требовало большого искусства и все же толщина их была слишком велика, возникает мысль о конструкции специального прибора для получения тонких срезов - микротома. Одна из первых попыток такого рода - «резательная машина» была по конструкции Каммингса описана Дж. Гиллом. Было и еще несколько аналогичных не удержавшихся конструкций Г Современный микротом ведет свое начало от микротома Ошатца (ученика Пуркине), сконструированного в 1844 г. Усовершенствованный немецким анатомом Велькером (Hermann Welcker, 1822-1897), микротом до конца прошлого столетия претерпел многочисленные реконструкции. Первые, так называемые цилиндрические, микротомы представляли собою объектодержатель, передвигавшийся при помощи микрометрического винта; срезы делались ручной бритвой, которую при изготовлении срезов проводили по платформе, расположенной в верхней части микротома. Вплоть до последней четверти XIX в. микротом не пользовался распространением, так как не было удовлетворительной методики заливки объектов с достаточным пропитыванием кусочков органов и тканей. Лишь в семидесятых годах, благодаря работам Гиса (Wilhelm His, 1831 - 1904), микротом начинает находить широкое применение и к концу прошлого столетия окончательно вытесняет изготовление срезов от руки. Применение микротома дало возможность изготовлять тонкие срезы и получать непрерывные серии срезов, что знаменовало собою большой успех в микроскопической технике.
Если, изучая ткани прижизненно, можно было заметить некоторые структуры, пользуясь неодинаковым преломлением света отдельными частями препарата (возникающим особенно при частичном отмирании тканей), то и эти ограниченные возможности были сведены на нет применением методов уплотнения и фиксации. Необходимо было найти способы выявления различных частей клетки после фиксации тканей и это было достигнуто применением окраски срезов. В 1858 году Корти (A. Corti, 1822-1876), исследуя (1854) орган слуха, важнейшая часть которого была названа его именем, употребил для окраски микроскопических препаратов кармин. Для ботанических объектов кармин был употреблен еще ранее Гёппертом и Коном (Goeppert und Cohn) в 1849 г. и Гартингом (Pieter Н. Harting, 1812-1885) в 1854 г. Но действительное распространение кармин получил лишь с 1858 г., когда Герлах (Josef Gerlach, 1820-1895) предложил рецепт аммиачного кармина. Ранвье, Гренахер (Н. Grenadier, 1879) и Пауль Мейер (Paul Meyer, 1881) разработали способы применения кармина в качестве красителя, специфически окрашивающего ядра, и в 80-х годах кармин был излюбленным красителем, которым пользовались в повседневной микроскопической технике.
В 1865 г. Бёмер (F. Bohmer) вводит в гистологическую технику новый краситель - гематоксилин, но вплоть до 90-х годов он не выдерживает конкуренции с кармином. Наоборот, с девяностых годов гематоксилиновая техника делает значительные успехи, постепенно гематоксилин вытесняет кармин и становится обычнейшей «ядерной» краской. Особое значение приобрел метод окраски гематоксилином с протравой железными квасцами, разработанный выдающимся гистологом конца XIX в. Мартином Гейденгайном в 1892 г. Этот метод и в настоящее время принадлежит к числу лучших способов окраски тончайших структур клеток.
Наконец, в 60-х годах начали употреблять для окраски микроскопических препаратов анилиновые красители, которые с 70-80-х годов находят широкое применение. Например, индигокармин введен в гистологическую технику Меркелем (Merkel) в 1874 г., эозин - Фишером (Ernst Fischer) в 1875 г., кислый фуксин - Эрлихом (Paul Ehrlich) в 1880 г., сафранин - Германом (Е. Hermann) в 1881 г.
Микроскопия обогащается новым арсеналом средств для выявления различных тканевых и клеточных структур, которые при применении надлежащих методов фиксации и окраски предстают перед наблюдателем с такой ясностью, о которой микроскописты первой половины XIX в. не могли даже и мечтать.
Упомянем о времени введения в микроскопическую технику некоторых других употребительных методов. Окраска гематоксилином и пикрофуксином введена Ван-Гизоном (Ira Thompson van Gieson, 1866-1913) в 1889 г.; широко известный метод окраски соединительной ткани по Маллори (Frank В. Mallory, 1862-1941) в оригинальной модификации предложен в 1900 г:, а его видоизменение - азановый метод М. Гейденгайн ввел в 1915 г. Столь употребительная теперь нуклеиновая реакция по Фёльгену (Robert Feulgen, 1884-1955) предложена в 1923 г. Применение методов серебрения начало широко внедряться после работ Гольджи, первая из которых опубликована в 1873 г. Метод серебрения Бильшовского (М. Bielschowsky, 1869-11940) предложен в 1903-1904 гг. Метиленовый синий для исследования нервной системы вошел в употребление после работ А. С. Догеля (1852-1922) и А. Е. Смирнова (1859-1910), произведенных в казанской лаборатории К. А. Арнштейна (1840-1919) и опубликованных в 1887 г.
На фиксированных, нарезанных на микротоме и окрашенных тончайших срезах перед взором микроскопистов конца XIX в. открылся целый таинственный мир расцвеченных в различные цвета структур. И гистологи конца прошлого века с увлечением принялись описывать эти невиданные структуры, открывать все новые и новые детали тонкого строения клетки. Порой это были действительно важные структурные части, порой с таким же увлечением описывались артефакты, искусственные образования, вызванные действием фиксаторов или дальнейшей обработкой препарата.
Вся последняя четверть истекшего столетия прошла под лозунгом проникновения в детали тонкого строения клетки. Накапливается громадный материал, учение о строении клетки обособляется в самостоятельную ветвь биологии - цитологию. В то время как в начале XIX в. учение о клетке разрабатывалось отдельными учеными, теперь цитология разрабатывается многочисленными исследователями. Крупные открытия являются обычно результатом целого ряда работ, и выяснить долю участия отдельных ученых в разработке той или другой проблемы является делом подчас трудным, подчас и невозможным. Мы дадим в последующем изложении исторический очерк успехов цитологии, сосредоточив внимание только на некоторых проблемах.
Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter .
ОП.01 Микробиология, санитария и гигиена в пищевом производстве.
Тема 1.1. Морфология и физиология микроорганизмов
Предмет, цели и задачи курса
План
1. Краткий исторический обзор возникновения и развития микробиологии, гигиены и санитарии в пищевом производстве.
2. Классификация микроорганизмов. Характеристика основных групп микроорганизмов: бактерии, плесневые грибы, дрожжи, ультрамикробы.
3. Техника микроскопирования: устройство микроскопа, приготовление препаратов.
Краткий исторический обзор возникновения и развития микробиологии, гигиены и санитарии в пищевом производстве.
Микробиология (греч. Micro – малый, bios – жизнь, logos – учение) – наука о мельчайших, невидимых невооруженным глазом организмах, названных микробами или микроорганизмами. Она изучает закономерности их жизни и развития, а также изменения, вызываемые ими в организме людей, животных, растений и в неживой природе.
В настоящее время в соответствии с потребностями общества микробиология дифференцировалась на:
· медицинскую – изучает патогенные микроорганизмы, вызывающие заболевания человека, и разрабатывает методы диагностики, профилактики и лечения этих болезней;
· сельскохозяйственную – изучает возбудителей, разрабатывает различные методы борьбы с ними, изучает роль микроорганизмов в образовании и плодородии почвы;
· ветеринарную – изучает возбудителей заболеваний животных, разрабатывает методы диагностики этих болезней, способы лечения;
· промышленную (биотехнология) – изучает вопросы совершенствования и расширения технологии по получению пищевого белка, пищевого сырья из непищевого, значительное расширение производства кормового белка для сельскохозяйственных животных;
· пищевую – изучает микроорганизмы, применяемые в изготовлении разнообразных пищевых продуктов путем микробиологического синтеза, а также способы предотвращения их порчи, вызываемой микроорганизмами;
· водную – исследует микроорганизмы водоемов, их роль в пищевых цепях, в загрязнении и очистке питьевой и сточных вод;
· геологическую – изучает роль микроорганизмов в образовании и разложении полезных ископаемых;
· генетическую – рассматривает молекулярные основы наследственности и изменчивости микроорганизмов, разрабатывает методы и принципы получения новых штаммов, полезных для человека;
· космическую – занимается изучением влияния космических условий на земные организмы;
· военную – создание и производство бактериологического оружия.
Краткий исторический обзор возникновения и развития микробиологии.
Микробиология – относительно молодая наука, ее история насчитывает не более 300 лет. В истории микробиологии можно выделить два периода, морфологический и физиологический. Первый связан с именем голландца Антония ван Левенгука (1632–1723), который в конце XVII в. создал первые микроскопы, увеличивающие предметы в 160-300 раз. Второй связан с именем великого французского ученого Луи Пастера (1822–1895), которым были сделаны следующие открытия:
1857 – брожение, 1860 – самопроизвольное зарождение, 1865 – болезни пива и вина, 1868 – болезни шелковичных червей, 1881 – зараза и вакцина, 1885 – предохранение от бешенства.
Эти открытия послужили фундаментом дальнейшего развития микробиологической науки.
Развитие микробиологии связано и с именами выдающихся русских ученых. И. И. Мечников (1845–1916) открыл защитные свойства организма (явление фагоцитоза), создал учение о невосприимчивости (иммунитете) организма к заразным заболеваниям. С. Н. Виноградский (1856–1953) – основоположник учения о роли микробов в плодородии почвы. Д. И. Ивановский (1864–1920) впервые обнаружил существование ультрамалых микробов-вирусов, положил начало науке по изучению фильтрующихся вирусов – вирусологии.
Изучение курса ставит задачей дать специалистам знания, необходимые для практической деятельности, исходя из того, что современные методы сохранения пищевых продуктов основаны на изучении жизнедеятельности микроорганизмов. Без знаний по микробиологии и санитарии невозможно осуществлять и совершенствовать микробиологический и санитарный контроль предприятий общественного питания, разрабатывать эффективные меры по предотвращению развития и уничтожению посторонней нежелательной микрофлоры, а также обеспечивать население доброкачественными продуктами питания.
Классификация микроорганизмов. Характеристика основных групп микроорганизмов: бактерии, плесневые грибы, дрожжи, ультрамикробы.
Микробы - это мельчайшие, преимущественно одноклеточные живые организмы, видимые только в микроскоп. Размер микроорганизмов измеряется в микрометрах - мкм (1/1000 мм) и нанометрах - нм (1/1000 мкм).
Микробы характеризуются огромным разнообразием видов, отличающихся строением, свойствами, способностью существовать в различных условиях среды. Они могут бытьодноклеточными, многоклеточными инеклеточными.
Микробы подразделяют на бактерии, вирусы и фаги, грибы, дрожжи.
БАКТЕРИИ.
Бактерии - преимущественно одноклеточные микроорганизмы размером от десятых долей микрометра, например микоплазмы, до нескольких микрометров, а у спирохет - до 500 мкм.
Различают три основные формы бактерий - шаровидные (кокки), палочковидные (бациллы и др.), извитые (вибрионы, спирохеты, спириллы) (рис. 1).
Рис. 1. Формы бактерий: 1 - микрококки; 2 - стрептококки; 3 - сардины; 4 - палочки без спор; 5 - палочки со спорами (бациллы); 6 - вибрионы; 7- спирохеты; 8 - спириллы (с жгутиками); 9 – стафилококки.
Шаровидные бактерии (кокки) имеют обычно форму шара, но могут быть немного овальной или бобовидной формы. Кокки могут располагаться поодиночке (микрококки); попарно (диплококки); в виде цепочек (стрептококки) или виноградных гроздьев (стафилококки), пакетом (сарцины). Стрептококки могут вызывать ангину и рожистое воспаление, стафилококки - различные воспалительные и гнойные процессы.
Палочковидные бактерии самые распространенные. Палочки могут быть одиночными, соединяться попарно (диплобактерии) или в цепочки (стрептобактерии). К палочковидным относятся кишечная палочка, возбудители сальмонеллеза, дизентерии, брюшного тифа, туберкулеза и др. Некоторые палочковидные бактерии обладают способностью при неблагоприятных условиях образовывать споры. Спорообразующие палочки называютбациллами. Бациллы, напоминающие по форме веретено, называютклостридиями.
Извитые бактерии могут быть в виде запятой - вибрионы, с несколькими завитками - спириллы, в виде тонкой извитой палочки - спирохеты. К вибрионам относится возбудитель холеры, а возбудитель сифилиса - спирохета.
Бактериальная клетка имеет клеточную стенку (оболочку), часто покрытую слизью. Нередко слизь образует капсулу. Содержимое клетки (цитоплазму) отделяет от оболочки клеточная мембрана. Цитоплазма представляет собой прозрачную белковую массу, находящуюся в коллоидном состоянии.
Микоплазмы - бактерии, лишенные клеточной стенки, нуждающиеся для своего развития в ростовых факторах, содержащихся в дрожжах.
Некоторые бактерии могут двигаться. Движение осуществляется с помощью жгутиков - тонких нитей разной длины, совершающих вращательные движения. Жгутики могут быть в виде одиночной длинной нити или в виде пучка, могут располагаться по всей поверхности бактерии. Жгутики есть у многих палочковидных бактерий и почти у всех изогнутых бактерий. Шаровидные бактерии, как правило, не имеют жгутиков, они неподвижны.
Размножаются бактерии делением на две части. Скорость деления может быть очень высокой (каждые 15-20 мин), при этом количество бактерий быстро возрастает. Такое быстрое деление наблюдается на пищевых продуктах и других субстратах, богатых питательными веществами.
ВИРУСЫ
Вирусы - особая группа микроорганизмов, не имеющих клеточного строения. Размеры вирусов измеряются нанометрами (8-150 нм), поэтому их можно увидеть только с помощью электронного микроскопа.
Вирусы вызывают такие распространенные болезни человека, как грипп, вирусный гепатит, корь, а также болезни животных - ящур, чуму животных и многие другие.
Вирусы бактерий называютбактериофагами , вирусы грибов -микофагами и т. п. Бактериофаги встречаются повсюду, где есть микроорганизмы. Фаги вызывают гибель микробной клетки и могут использоваться для лечения и профилактики некоторых инфекционных заболеваний.
ГРИБЫ
Грибы являются особыми растительными организмами, которые не имеют хлорофилла и не синтезируют органические вещества, а нуждаются в готовых органических веществах. Поэтому грибы развиваются на различных субстратах, содержащих питательные вещества. Некоторые грибы способны вызывать болезни растений (рак и фитофтора картофеля и др.), насекомых, животных и человека.
Клетки грибов отличаются от бактериальных наличием ядер и вакуолей и похожи на растительные клетки. Чаще всего они имеют форму нитей -гифов. Из гифов образуетсямицелий, или грибница.
Грибы могут размножаться разными путями, в том числе вегетативным путем в результате деления гиф. Большинство грибов размножаются бесполым и половым путями при помощи образования специальных клеток размножения -спор.
Обширную группу грибов представляют плесневые грибы (рис. 2). Широко распространенные в природе, они могут расти на пищевых продуктах, образуя хорошо видные налеты разной окраски. Причиной порчи продуктов часто являются мукоровые грибы, образующие пушистую белую или серую массу. Мукоровый гриб ризопус вызывает «мягкую гниль» овощей и ягод, а гриб ботритис покрывает налетом и размягчает яблоки, груши и ягоды. Возбудителями плесневения продуктов могут быть грибы из рода пениииллиум.
Отдельные виды грибов способны не только приводить к порче продуктов, но и вырабатывать токсические для человека вещества - микотоксины. К ним относятся некоторые виды грибов рода аспергиллус, рода фузариум и др.
Полезные свойства отдельных видов грибов используют в пищевой и фармацевтической промышленности и других производствах. Например, грибы рода пениииллиум применяются для получения антибиотика пенициллина и в производстве сыров (рокфора и камамбера), грибы рода аспергиллус - в производстве лимонной кислоты и многих ферментных препаратов.
Актиномицеты - микроорганизмы, имеющие признаки и бактерий, и грибов. По строению и биохимическим свойствам актиномицеты аналогичны бактериям, а по характеру размножения, способности образовывать гифы и мицелий похожи на грибы.
Рис. 2. Виды плесневых грибов: 1 - пениииллиум; 2- аспергиллус; 3 - мукор.
ДРОЖЖИ
Дрожжи - одноклеточные неподвижные микроорганизмы размером не более 10-15 мкм. Форма клетки дрожжей бывает чаще круглой или овальной, реже палочковидной, серповидной или похожей на лимон. Клетки дрожжей своим строением похожи на грибы, они также имеют ядро и вакуоли. Размножение дрожжей происходит почкованием, делением или спорами.
Дрожжи широко распространены в природе, их можно обнаружить в почве и на растениях, на пищевых продуктах и различных отходах производства, содержащих сахара. Развитие дрожжей в пищевых продуктах может приводить к их порче, вызывая брожение или закисание. Некоторые виды дрожжей обладают способностью превращать сахар в этиловый спирт и углекислый газ. Этот процесс называется спиртовым брожением и широко используется в пищевой промышленности и виноделии.
Некоторые виды дрожжей кандида вызывают заболевание человека - кандидоз.
Техника микроскопирования: устройство микроскопа, приготовление препаратов.
Для исследования дрожжей, бактерий и плесневых грибов применяют микроскопы, предназначенные для рассмотрения прозрачных препаратов в проходящем свете (рис. 3).
Рис. 3. Микроскоп МБИ-1: 1 - зеркало, 2 - конденсор, 3 - предметный столик, 4 - объективы, 5 - револьвер, 6 - окуляр, 7 - тубус, 8 - тубусодержатель, 9 - макрометрический винт, 10 - микрометрический винт, 11 - ножка
Оптическая часть микроскопа . Основной частью оптической системы микроскопа является объектив, увеличивающий изображение предмета. Он состоит из ряда линз, склеенных канадским бальзамом и заключенных в металлическую трубку; на трубке имеется резьба, при помощи которой объектив ввинчивается в специальное гнездо револьвера.
Изображение, даваемое объективом, рассматривают с помощью окуляра, находящегося в верхней части тубуса микроскопа. Биологические микроскопы снабжаются тремя сменными окулярами. На верхней оправе линзы окуляра указано его увеличение. Обычно окуляры дают увеличение в 7, 10 и 15 раз. Общее увеличение объекта микроскопом равно произведению увеличения окуляра на увеличение объектива = 900 раз.
Осветительное устройство располагается под столиком микроскопа и состоит из конденсора с ирис-диафрагмой и зеркала.
Механическая часть микроскопа . Эта часть состоит из штатива, тубусодержателя с револьвером, винтов для передвижения тубуса (макрометрического и микрометрического), осветительного аппарата и предметного столика микроскопа. Основными частями штатива являются нижняя подставка (ножка), придающая микроскопу устойчивость, и тубусодержатель микроскопа.
Техника микроскопирования . Прежде чем начать микроскопирование, необходимо установить правильное освещение. Для этого с микроскопа снимают окуляр и, глядя прямо в объектив, устанавливают зеркало так, чтобы источник света (лампа или окно) были видны посредине объектива. После предварительной установки света на предметный столик микроскопа кладут готовый препарат и закрепляют его зажимами. При помощи макрометрического винта опускают тубус почти до соприкосновения с покровным стеклом. Затем, глядя в окуляр, постепенно поднимают тубус до появления изображения. Для наведения резкости пользуются микрометрическим винтом.
При микроскопиравании следует держать оба глаза открытыми. Смотрят в микроскоп левым глазом.
Техника приготовления препарата для микроскопирования . Каплю исследуемой жидкости наносят на чистое предметное стекло и осторожно накрывают покровным стеклом. Если препарат готовят с плотной питательной среды, то на предметное стекло наносят капельку чистой водопроводной воды, в нее помещают исследуемую культуру и препарат накрывают покровным стеклом. Под последним не должно оставаться пузырьков воздуха, так как они мешают микроскопированию. Избыток жидкости, выступающий из-за покровного стекла, убирают фильтровальной бумагой, заранее нарезанной небольшими узкими полосками. Готовый препарат помещают на предметный столик и исследуют.
Для обнаружения и исследования микроорганизмов применяют световые микроскопы разных моделей («МБИ-1», «Биолам», «Бимам», «Микмед»). Для изучения более мелких объектов (вирусов) используют электронные микроскопы.
Все микроскопы устроены одинаково и состоят из механической части и оптической системы. Механическая часть состоит из основания штатива (1), предметного столика (2), тубусодержателя (3), револьвера объектива (4), макровинта (5) - для перемещения тубуса, микровинта (6) – для тонкой фокусировки. Оптическая часть микроскопа состоит из объективов (7), окуляров (8) и осветительного устройства (9). Объективы представляют собой систему линз, одна из которых производит увеличение, а все остальные корригируют изображение. Окуляры состоят из двух линз (собирающей и глазной). Они увеличивают изображение, получаемое с помощью объектива. Осветительное устройство (зеркало, ирис-диафрагма и конденсор).
1. Препарат помещают на предметный столик микроскопа и закрепляют его боковыми зажимами.
2. Вращая револьвер, устанавливают объектив малого увеличения 8х.
3. Находят правильное освещение препарата. Для этого, пользуясь плоским зеркалом, или светильником направляют свет от источника в конденсор микроскопа, стремясь получить равномерное освещение поля зрения. Лучшее освещение подбирают поднятием или опусканием конденсора и при помощи диафрагмы.
4. Находят изображение при малом увеличении (объектив 8х), фокусируя макрометрическим винтом.
5. Без поднятия тубуса, вращая револьвер, заменяют объектив малого увеличения на объективы большого увеличения (40х, 90х).
6. При использовании иммерсионного объектива (90х) открывают диафрагму конденсора, чтобы увеличить свет. На препарат наносят каплю иммерсионного (кедрового) масла. Затем, глядя на препарат сбоку (для контроля, чтобы не раздавить стекло и не поцарапать фронтальную линзу объектива), очень осторожно погружают объектив 90х в масло почти до соприкосновения с поверхностью стекла, работая макрометрическим винтом. Далее очень медленно поднимают тубус при помощи макровинта до появления в поле зрения изучаемого объекта. Наконец, резкость изображения устанвливают микрометрическим винтом.
При микроскопии в темном поле лучи, освещающие объект не попадают в объектив микроскопа, поле зрения остается темным, а объект на его фоне кажется светящимся. Эффект темного поля создается при помощи специального конденсора.
С помощью фазово-контрастной микроскопии могут быть исследованы без предварительной обработки бесцветные, прозрачные объекты. Для работы по методу фазового контраста, нужно кроме обычного биологического микроскопа, иметь еще специальное устройство. Для этого конденсор и объектив заменяют фазовыми. Фазовый конденсор поворотом револьверного диска устанавливают на 0. Это положение соответствует светопольному конденсору.
Современный микроскоп – это точный оптический прибор, требующий строгого соблюдения ряда правил при работе с ним. Хранить микроскоп нужно закрытым от пыли (под чехлом или под специальным стеклянным колпаком). Время от времени следует проверять чистоту и состояние оптики и протирать ее только снаружи с помощью волосяной кисточки или мягкой ткани, смоченной спиртом. Раз в год микроскоп должен просмотреть и при необходимости отремонтировать мастер-оптик.
Микроскопическая техника - это комплекс приемов и правил обращения и работы с микроскопом и его вспомогательными частями.
При работе с микроскопом прежде всего необходимо оберегать его от загрязнений (в промежутках между работой его накрывают стеклянным или картонным колпаком). Не рекомендуется часто вывинчивать объективы: срабатывается резьба и нарушается их центровка. Оптическую часть тщательно протирают много раз стиранной незагрязненной батистовой или полотняной тряпочкой, следы грязи удаляют тампоном, смоченным 95% спиртом, а затем протирают сухим тампоном. Масло снимают с поверхности линзы сухой мягкой тряпкой, а его остатки можно удалять ксилолом. С механической части прибора удаляют . Сложная чистка и смазка производится специалистом.
Работа с современными микроскопами требует применения рационального освещения, тщательного выбора оптической системы «объектив - окуляр - конденсор», а также предметных и покровных стекол необходимого качества, соответствующей подготовки препарата - объекта исследования. В качестве точечных источников света служат осветители ОИ-7, ОИ-9, ОИ-18, ОИ-19, снабженные коллекторной линзой. Осветитель устанавливают на расстоянии 30-40 см перед микроскопом. Не следует слишком ярко освещать , так как это снижает качество изображения. Установив освещение, регулируют угловую апертуру конденсора, открыв полностью апертурную диафрагму и закрыв полностью диафрагму поля (коллектора), наблюдают в микроскоп светящийся кружок (отверстие диафрагмы). Затем постепенно суживают апертурную диафрагму до момента, когда в поле зрения будет видно пятно без голубой или зеленой каймы. Качество изображения зависит от рационального применения объективов и окуляров. Пользуясь различными сочетаниями объективов и окуляров, можно получить различные увеличения. Однако выбор нужного увеличения должен определяться прежде всего объектом, целями исследования и разрешающей способностью микроскопа.
При бактериоскопии, как правило, применяются иммерсионные объективы (масляный, водный, глицериновый). Для получения хорошего изображения без применения покровного стекла рекомендуется употреблять специальное иммерсионное масло, каплю которого наносят на мазок, расположенный на предметном стекле. При работе с иммерсионным объективом нужно очень осторожно опускать тубус, чтобы не повредить фронтальную линзу объектива. Качество изображения зависит и от толщины предметного стекла (не больше 1,1-1,4 мм) и покровного стеклышка (не толще 0,15-0,17 мм).
Вспомогательными приборами при микроскопии служат: нагревательный столик, окуляр-микрометр, объект-микрометр, рисовальный аппарат и микроманипулятор.
Нагревательный столик устанавливается вместо предметного стола. Степень нагрева регулируется терморегулятором. Препарат на таком столике устанавливается, как и на обычном предметном столике микроскопа.
Окуляр-микрометр дает возможность измерения наблюдаемых объектов. С этой целью фокусируют объектив на шкале объект-микрометра, каждое деление которого равно 10 мк.
Важным разделом микроскопической техники является зарисовка объекта исследования. Рисунок можно сделать визуально или более точно при помощи рисовального аппарата. При визуальном методе в микроскоп смотрят левым глазом, а правым следят за движением карандаша на бумаге. Рисовальный аппарат насаживается на тубус микроскопа. Зеркало отбрасывает через призму изображение бумаги и карандаша, рисующего в плоскости глазной точки окуляра, в глаз, поэтому наблюдатель одновременно видит объект, бумагу и кончик карандаша.
Микроманипулятор позволяет осуществлять тонкие и точные движения микроинструментов и выполнять в поле микроскопа некоторые операции на клетке (удаление и ядер, инъекции различных веществ, отрезание различных участков и т. д.). Он состоит из системы штативов, снабженных винтами, зажимающими микроинструменты, что обеспечивает движение микроинструментов во всех направлениях.
Живые объекты () помещают на предметное стекло в каплю наиболее подходящей для них среды (можно изотонический раствор хлорида натрия) и, накрыв покровным стеклом (), рассматривают в проходящем свете в светлом или темном поле. Фиксированные и окрашенные препараты бактерий изготовляют в виде мазков или отпечатков (см. Окраска микроорганизмов).
Микроскопирование препаратов - см. Микроскопия. См. также Микроскоп.
Микроскопическая техника - правила обращения и работы с микроскопом и его вспомогательными приборами.
Важное условие успеха микроскопирования - установка освещения. Только при оптимальном освещении по Келеру (рис. 1) можно реализовать все возможности микроскопа. Чтобы установить освещение по Келеру, необходимо иметь стандартный осветитель типа ОИ-7 (рис. 2) или ОИ-19 с микролампой (с небольшой, плотно скрученной спиралью), которую можно передвигать вдоль оси осветителя. При этом свет микролампы фокусируется линзой-коллектором, и на некотором расстоянии от осветителя возникает резкое изображение спирали лампы. Площадь линзы ограничивается ирис-диафрагмой переменной величины. Резкое изображение спирали лампы направляют через зеркало микроскопа на закрытую до отказа диафрагму конденсора, представляющего светосильную короткофокусную систему линз, которая собирает весь входящий в нее световой поток на очень малый участок объекта. Весь осветитель перемещают по столу до тех пор, пока изображение спирали лампы не покроет всю диафрагму конденсора. Этот момент замечают, глядя спереди на плоское зеркало микроскопа, в котором отражается диафрагма конденсора. Если нужно, лампу в осветителе передвигают вдоль оси, пока изображение спирали не достигнет нужной величины, после чего полностью открывают диафрагму конденсора.
Рис. 1. Схематическое изображение хода лучей при освещении препарата по методу Келера: 1 - нить лампы; 2 - коллектор; 3 - диафрагма поля; 4 - изображение нити лампы в плоскости апертурной диафрагмы; 5 - апертурная диафрагма; в - конденсор; 7 - изображение краев диафрагмы поля в плоскости препарата.
Рис. 2. Микроскоп МВИ-1 с осветителем ОИ-7.
Затем на предметный столик микроскопа ставят препарат и фокусируют на нем тот объектив, с которым собираются работать.
Глядя в окуляр, движением плоского зеркала добиваются наилучшего в этих условиях освещения. Затем закрывают до упора диафрагму осветителя. Если при этом ее изображение уходит из поля зрения, его нужно вернуть движением зеркала. Поднимая или опуская конденсор, стараются сделать изображение диафрагмы осветителя резким. Этим определяется оптимальная высота конденсора при его взаимодействии с данным объективом (при работе с объективами малых увеличений приходится отвинчивать верхнюю линзу конденсора, чтобы согласовать его работу с возможностями объектива). При смене объектива изображение закрытой диафрагмы осветителя следует снова сфокусировать в фокальной плоскости объектива.
Движением зеркала изображение диафрагмы осветителя переводят в центр поля зрения. Если края изображения окрашены неодинаково (один полюс синеватый, другой - красноватый), это значит, что ось осветителя наклонена к вертикальной плоскости микроскопа. Наблюдая через окуляр, перемещают осветитель вручную так, чтобы окраска краев изображения стала одинаковой по всей его окружности. Освещенность поля зрения становится равномерной по всей площади. Остается раскрыть диафрагму осветителя настолько, чтобы ее изображение точно вписалось в поле зрения данного объектива. Световой поток будет при этом использоваться полностью и не возникнет избыточных световых пучков, которые могут породить помехи в изображении. Теперь при помощи реостата, изменяющего питание осветителя, устанавливают такой накал лампы, при котором глаз не утомляется излишней яркостью и без труда различает мельчайшие детали.
Установка освещения по Келеру - обязательное условие квалифицированной работы с микроскопом. Нарушение правильного освещения неизбежно ведет к потере разрешения и контраста, к оптическим ошибкам, особенно при микрофотографии и микрокиносъемке.
К современным микроскопам придаются различные приспособления для автоматической и полуавтоматической установки освещения. Их использование облегчает установку освещения, но не отменяет метода Келера. На базе стандартного освещения по Келеру, проделав некоторые дополнительные операции, налаживают работу всех остальных видов микроскопов. Так, например, для перехода к темнопольной микроскопии нужно после установки стандартного освещения заменить обычный конденсор темнопольным (не меняя положения остальных узлов микроскопа) и, наблюдая в окуляр, медленно поднимать его до тех пор, пока не возникнет темнопольное изображение - сверкающие частицы объекта на почти черном фоне. Предметное стекло для темнопольной микроскопии должно иметь толщину 1 -1,2 мм, иначе конденсором нельзя сфокусировать свет на объекте.
Переход к фазово-контрастной микроскопии несколько сложнее. Конденсор фазово-контрастного устройства имеет в фокальной плоскости барабан с набором кольцевых диафрагм разного размера (см. рис. 2 в ст. «Микроскопия»), Цифры, появляющиеся в окне барабана при его повороте, показывают, каким объективом (х10, х20, х40 или х90) следует пользоваться при диафрагме, величина которой видна в окне в данный момент; цифра О означает отсутствие диафрагмы (работа конденсора в обычном режиме). В этом положении устанавливают стандартное освещение. Затем фокусируют на препарате намеченный к работе объектив.
Изображение, как правило, видно очень плохо, но нужно добиться его фокусировки. Поворотом барабана устанавливают нужную кольцевую диафрагму. Вместо окуляра вставляют вспомогательный микроскоп, имеющийся в комплекте фазово-контрастного устройства. Он облегчает рассмотрение зоны, где формируется изображение.
Перемещая окуляр этого микроскопа, добиваются резкой видимости двух колечек различной плотности, расположенных в глубине тубуса микроскопа. Одно из них образовано кольцевой щелью в диафрагме конденсора; другое представляет собой так называемую фазовую пластинку - полупрозрачное колечко из специального покрытия, нанесенное на одну из линз объектива. Изображения этих колечек, как правило, не совпадают друг с другом. Движением центрирующих винтов, расположенных под барабаном, перемещают диафрагму так, чтобы ее изображение полностью совпало с фазовой пластинкой. После этого заменяют вспомогательный микроскоп обычным окуляром и начинают наблюдение фазово-контрастированного изображения.
Примерно такими же приемами можно получить амплитудное контрастирование в микроскопах амплитудно-контрастного (аноптрального) типа.
После смены препарата следует проверить, сохранились ли условия освещения, так как толщина предметных стекол колеблется и плоскость объекта может не совпасть с ранее установленной плоскостью фокуса конденсора. Для проверки нужно закрыть диафрагму осветителя. Если ее изображение при объективе, сфокусированном на новом препарате, окажется нерезким, нужно изменить высоту конденсора, после чего снова открыть диафрагму до размера поля зрения.
Микроскопирование лучше вести при помощи бинокулярной насадки; она распределяет световую нагрузку на оба глаза, которые в результате меньше утомляются при длительной работе.
Несмотря на значительные успехи микрофотографии и микрокиносъемки за последние годы, рисовальные аппараты остаются весьма полезными при работе с толстыми, многоплановыми объектами, которые невозможно сфотографировать из-за большой глубины. Промышленность выпускает рисовальный аппарат РА-4, пользование которым не вызывает затруднений. Аппаратура для микрофотосъемки (микро-фотонасадка МФН и др.) проста, доступна и удобна в обращении. Однако получение высококачественных микрофотографий требует большой практики.
Окончив работу с микроскопом, нужно прикрыть его от пыли. Если использовали иммерсионный объектив, кедровое масло нужно осторожно стереть чистой ладонью и отмыть его следы с фронтальной линзы объектива чистой тряпочкой, слегка увлажненной бензином или ксилолом (обильно смачивать нельзя, так как эти вещества могут растворить клей, скрепляющий линзы объектива).
Правила ухода за микроскопом описаны в инструкции к нему.
Бактериоскопия - это исследование бактерий при помощи светового микроскопа - широко применяется в медицинской практике. Бактериоскопическому исследованию (см. Бактериологическое исследование) подвергают фиксированные окрашенные препараты, а также бактерии в живом состоянии в препаратах «висячая» или «раздавленная» капли (см. Висячая капля, Раздавленная капля).
Изготовление микроскопических препаратов - см. Бактериологическая техника. Бактериологическое исследование, Вирусологические исследования, Гистологическая техника. К любому микроскопическому препарату предъявляется одно общее требование: толщина предметного стекла не должна превышать 1,2-1,4 мм, покровного - 0,4 мм.
