MICROSCOPIO ELETTRONICO
un dispositivo che permette di ottenere immagini fortemente ingrandite di oggetti utilizzando gli elettroni per illuminarli. Un microscopio elettronico (EM) consente di vedere dettagli troppo piccoli per essere risolti da un microscopio ottico (ottico). EM è uno dei dispositivi più importanti per i fondamentali ricerca scientifica la struttura della materia, soprattutto in campi della scienza come la biologia e la fisica dello stato solido. Esistono tre tipi principali di EM. Negli anni '30 fu inventato il microscopio elettronico a trasmissione convenzionale (CTEM), negli anni '50 il microscopio elettronico raster (a scansione) (SEM) e negli anni '80 il microscopio a tunnel a scansione (RTM). Questi tre tipi di microscopi si completano a vicenda nello studio di strutture e materiali di diverso tipo.
MICROSCOPIO ELETTRONICO A TRASMISSIONE CONVENZIONALE
L'OPEM è per molti versi simile a un microscopio ottico (vedi MICROSCOPIO), ma utilizza un raggio di elettroni anziché la luce per illuminare i campioni. Contiene un faretto elettronico (vedi sotto), una serie di lenti condensatrici, una lente obiettiva e un sistema di proiezione che si adatta all'oculare ma proietta l'immagine reale su uno schermo fluorescente o una lastra fotografica. La sorgente di elettroni è solitamente un catodo riscaldato di esaboruro di tungsteno o lantanio. Il catodo è isolato elettricamente dal resto del dispositivo e gli elettroni vengono accelerati da un forte campo elettrico. Per creare un tale campo, il catodo viene mantenuto ad un potenziale di circa -100.000 V rispetto ad altri elettrodi, che focalizzano gli elettroni in un fascio stretto. Questa parte dell'apparecchio è chiamata riflettore elettronico (vedi PISTOLA ELETTRONICA). Poiché gli elettroni sono fortemente dispersi dalla materia, nella colonna del microscopio deve esserci un vuoto dove gli elettroni si muovono. Qui la pressione viene mantenuta non superiore ad un miliardesimo della pressione atmosferica.
Ottica elettronica. Un'immagine elettronica è formata da campi elettrici e magnetici più o meno allo stesso modo in cui un'immagine luminosa è formata da lenti ottiche. Il principio di funzionamento di una lente magnetica è illustrato dal diagramma (Fig. 1). Il campo magnetico creato dalle spire della bobina attraverso cui passa la corrente agisce come una lente collettrice, che può essere modificato cambiando la corrente. Poiché la potenza ottica di tale obiettivo, ad es. la capacità di focalizzare gli elettroni dipende dall'intensità del campo magnetico vicino all'asse; per aumentarla è opportuno concentrare il campo magnetico nel minor volume possibile. In pratica, ciò si ottiene grazie al fatto che la bobina è quasi completamente ricoperta da una "armatura" magnetica realizzata in una speciale lega di nichel-cobalto, lasciando solo uno stretto spazio nella sua parte interna. Il campo magnetico creato in questo modo può essere 10-100mila volte più forte del campo magnetico terrestre sulla superficie terrestre.
Il diagramma OPEM è mostrato in Fig. 2. Una serie di lenti condensatrici (è mostrata solo l'ultima) focalizza il fascio di elettroni sul campione. Tipicamente, il primo crea un'immagine non ingrandita della sorgente di elettroni, mentre il secondo controlla la dimensione dell'area illuminata sul campione. L'apertura dell'ultima lente del condensatore determina l'ampiezza del fascio nel piano dell'oggetto. Il campione viene posto nel campo magnetico di una lente obiettiva ad alto potere ottico, la lente più importante dell'OPEM, che determina la limitazione possibile risoluzione dispositivo. Le aberrazioni in una lente obiettiva sono limitate dalla sua apertura, proprio come in una macchina fotografica o in un microscopio ottico. Una lente obiettiva produce un'immagine ingrandita di un oggetto (solitamente un ingrandimento di circa 100); l'ingrandimento aggiuntivo introdotto dalle lenti intermedie e di proiezione varia da poco meno di 10 a poco più di 1000. Pertanto, l'ingrandimento che può essere ottenuto nei moderni OPEM varia da meno di 1000 a 1.000.000 MICROSCOPIO ELETTRONICO (A un milione di ingrandimento pompelmo cresce fino alle dimensioni della Terra.) L'oggetto da studiare viene solitamente posizionato su una rete molto fine posta in un supporto speciale. Il supporto può essere spostato meccanicamente o elettricamente senza problemi su e giù, a sinistra e a destra.
Immagine. Il contrasto nell'OPEM è dovuto alla diffusione degli elettroni mentre il fascio di elettroni passa attraverso il campione. Se il campione è sufficientemente sottile, la frazione di elettroni dispersi è piccola. Quando gli elettroni attraversano un campione, alcuni di essi vengono dispersi a causa delle collisioni con i nuclei degli atomi del campione, altri vengono dispersi a causa delle collisioni con gli elettroni degli atomi e altri ancora lo attraversano senza subire diffusione. Il grado di diffusione in qualsiasi regione del campione dipende dallo spessore del campione in quella regione, dalla sua densità e dalla massa atomica media (numero di protoni) in un dato punto. Gli elettroni che escono dal diaframma con una deviazione angolare superiore a un certo limite non possono più ritornare al raggio che trasporta l'immagine, e quindi aree ad alta dispersione di maggiore densità, maggiore spessore e posizioni di atomi pesanti appaiono nell'immagine come zone scure su una luce. sfondo. Tale immagine è chiamata campo chiaro perché in essa il campo circostante è più luminoso dell'oggetto. Ma è possibile fare in modo che il sistema di deflessione elettrica consenta solo ad una parte degli elettroni dispersi di passare nel diaframma dell'obiettivo. Il campione appare quindi chiaro su un campo scuro. Spesso è più conveniente visualizzare un oggetto con scarsa diffusione in modalità campo scuro. L'immagine elettronica finale ingrandita viene convertita in un'immagine visibile da uno schermo fluorescente, che si illumina sotto il bombardamento di elettroni. Questa immagine, solitamente a basso contrasto, viene generalmente visualizzata attraverso un microscopio ottico binoculare. Alla stessa luminosità, un microscopio di questo tipo con un ingrandimento di 10 può creare un'immagine sulla retina che è 10 volte più grande di quella osservata ad occhio nudo. A volte, per aumentare la luminosità di un'immagine debole, viene utilizzato uno schermo ai fosfori con un convertitore elettrone-ottico. In questo caso, l'immagine finale può essere visualizzata su un normale schermo televisivo, consentendone la registrazione su videocassetta. La registrazione video viene utilizzata per registrare immagini che cambiano nel tempo, ad esempio, a causa del verificarsi di una reazione chimica. Molto spesso, l'immagine finale viene registrata su pellicola fotografica o lastra fotografica. Una lastra fotografica produce solitamente un'immagine più chiara di quella osservata ad occhio nudo o registrata su videocassetta, poiché i materiali fotografici, in generale, registrano gli elettroni in modo più efficiente. Inoltre, per unità di area di pellicola fotografica è possibile registrare 100 volte più segnali che per unità di area di videocassetta. Grazie a ciò l'immagine registrata su pellicola fotografica può essere ulteriormente ingrandita di circa 10 volte senza perdita di nitidezza.
Autorizzazione. I fasci di elettroni hanno proprietà simili a quelle dei raggi luminosi. In particolare ogni elettrone è caratterizzato da una specifica lunghezza d'onda. La risoluzione di un EM è determinata dalla lunghezza d'onda effettiva degli elettroni. La lunghezza d'onda dipende dalla velocità degli elettroni, e quindi dalla tensione di accelerazione; Maggiore è la tensione di accelerazione, maggiore è la velocità degli elettroni e più corta è la lunghezza d'onda, il che significa maggiore è la risoluzione. Un vantaggio così significativo dell'EM in termini di risoluzione è spiegato dal fatto che la lunghezza d'onda degli elettroni è molto più corta della lunghezza d'onda della luce. Ma poiché le lenti elettroniche non mettono a fuoco così bene come le lenti ottiche (l'apertura numerica di una buona lente elettronica è solo 0,09, mentre per una buona lente ottica questo valore raggiunge 0,95), la risoluzione EM è pari a 50-100 lunghezze d'onda elettroniche. Anche con lenti così deboli un microscopio elettronico può raggiungere un limite di risoluzione di ca. 0,17 nm, che consente di distinguere i singoli atomi nei cristalli. Per ottenere una risoluzione di questo ordine è necessaria una regolazione molto attenta dello strumento; in particolare sono necessari alimentatori altamente stabili e il dispositivo stesso (che può essere alto circa 2,5 m e pesare diverse tonnellate) e il suo attrezzatura aggiuntiva richiedono un'installazione che elimini le vibrazioni.
MICROSCOPIO ELETTRONICO RASTER
Il SEM, divenuto uno strumento essenziale per la ricerca scientifica, costituisce un buon complemento all'OPEM. I SEM utilizzano lenti elettroniche per focalizzare un fascio di elettroni in un punto molto piccolo. È possibile regolare il SEM in modo che il diametro del punto in esso contenuto non superi 0,2 nm, ma, di regola, è di poche o decine di nanometri. Questo punto corre continuamente attorno a una certa area del campione, simile a un raggio che corre attorno allo schermo di un tubo televisivo. Il segnale elettrico generato quando un oggetto viene bombardato da un fascio di elettroni viene utilizzato per formare un'immagine sullo schermo di un cinescopio televisivo o di un tubo a raggi catodici (CRT), la cui scansione è sincronizzata con il sistema di deflessione del fascio di elettroni (Fig. 3) . L'ingrandimento in questo caso è inteso come il rapporto tra la dimensione dell'immagine sullo schermo e la dimensione dell'area coperta dal raggio sul campione. Questo aumento è compreso tra 10 e 10 milioni.
L'interazione degli elettroni del fascio focalizzato con gli atomi del campione può portare non solo alla loro diffusione, utilizzata per ottenere immagini in OPEM, ma anche all'eccitazione di raggi X, all'emissione di luce visibile e all'emissione di elettroni secondari. Inoltre, poiché il SEM dispone solo di lenti di focalizzazione davanti al campione, consente l'esame di campioni “spessi”.
SEM riflettente. Il SEM riflettente è progettato per lo studio di campioni massicci. Poiché il contrasto che si verifica durante la registrazione si riflette, ad es. Gli elettroni retrodiffusi e secondari sono principalmente legati all'angolo di incidenza degli elettroni sul campione, la struttura superficiale è rivelata nell'immagine. (L'intensità della retrodiffusione e la profondità alla quale avviene dipendono dall'energia degli elettroni del fascio incidente. L'emissione di elettroni secondari è determinata principalmente dalla composizione della superficie e dalla conduttività elettrica del campione.) Entrambi questi fattori i segnali trasportano informazioni su caratteristiche generali campione. Grazie alla bassa convergenza del fascio di elettroni, è possibile effettuare osservazioni con una profondità di campo molto maggiore rispetto a quando si lavora con un microscopio ottico, e ottenere eccellenti micrografie volumetriche di superfici con un rilievo molto sviluppato. Registrando la radiazione X emessa da un campione, oltre ai dati di rilievo, si possono ottenere informazioni a riguardo composizione chimica campione nello strato superficiale con una profondità di MICROSCOPIO ELETTRONICO 0,001 mm. La composizione del materiale sulla superficie può essere giudicata anche dall'energia misurata con cui vengono emessi determinati elettroni. Tutte le difficoltà di lavorare con SEM sono principalmente dovute ai suoi sistemi di registrazione e visualizzazione elettronica. Il dispositivo con una gamma completa di rilevatori, insieme a tutte le funzioni SEM, prevede la modalità operativa di un microanalizzatore a sonda elettronica.
Microscopio elettronico a trasmissione a scansione. Un microscopio elettronico a trasmissione a scansione (RTEM) lo è tipo speciale SEM. È progettato per campioni sottili, gli stessi studiati in OPEM. Il diagramma RPEM differisce dal diagramma di Fig. 3 solo perché non dispone di rilevatori posizionati sopra il campione. Poiché l'immagine è formata da un raggio viaggiante (anziché da un raggio che illumina l'intera area del campione oggetto di studio), è necessaria una sorgente di elettroni ad alta intensità affinché l'immagine possa essere registrata in un tempo ragionevole. Gli RTEM ad alta risoluzione utilizzano emettitori di campo ad alta luminosità. In una tale sorgente di elettroni, un campo elettrico molto forte (circa V/cm) viene creato vicino alla superficie di un filo di tungsteno di diametro molto piccolo affilato mediante incisione. Questo campo estrae letteralmente miliardi di elettroni dal filo senza alcun calore. La luminosità di una tale sorgente è quasi 10.000 volte maggiore rispetto alla sorgente di filo di tungsteno riscaldato (vedi sopra) e gli elettroni emessi da essa possono essere focalizzati in un raggio con un diametro inferiore a 1 nm. Sono stati ottenuti addirittura fasci con diametro prossimo a 0,2 nm. Le sorgenti elettroniche di campo possono funzionare solo in condizioni di ultra-alto vuoto (a pressioni inferiori a Pa), in cui contaminanti come vapori di idrocarburi e acqua sono completamente assenti, e diventa possibile ottenere immagini con alta risoluzione. Grazie a tali condizioni ultrapure, è possibile studiare processi e fenomeni inaccessibili all'EM con quello convenzionale sistemi di vuoto. Gli studi RPEM vengono condotti su campioni ultrasottili. Gli elettroni passano attraverso tali campioni quasi senza dispersione. Gli elettroni sparsi ad angoli di più di qualche grado senza rallentamento vengono registrati quando colpiscono un elettrodo ad anello situato sotto il campione (Fig. 3). Il segnale captato da questo elettrodo dipende fortemente dal numero atomico degli atomi nella regione attraverso la quale passano gli elettroni: gli atomi più pesanti diffondono più elettroni verso il rilevatore rispetto agli atomi più leggeri. Se il fascio di elettroni viene focalizzato su un punto di diametro inferiore a 0,5 nm, è possibile acquisire l'immagine dei singoli atomi. Nell'immagine ottenuta nell'RTEM, infatti, è possibile distinguere i singoli atomi con la massa atomica del ferro (cioè 26 o più). Gli elettroni che non hanno subito diffusione nel campione, così come gli elettroni che hanno rallentato a causa dell'interazione con il campione, passano nel foro del rilevatore ad anello. Un analizzatore di energia situato sotto questo rilevatore permette di separare il primo dal secondo. Misurando l'energia persa dagli elettroni durante la diffusione, si può ottenere informazioni importanti sul campione. Le perdite di energia associate all'eccitazione della radiazione a raggi X o all'espulsione di elettroni secondari dal campione consentono di giudicare le proprietà chimiche della sostanza nella regione attraverso la quale passa il fascio di elettroni.
MICROSCOPIO A TUNNEL RASTER
Gli EM discussi sopra utilizzano lenti magnetiche per focalizzare gli elettroni. Questa sezione dedicato all'EM senza lenti. Ma prima di passare al microscopio a effetto tunnel (RTM), sarà utile esaminare brevemente due tipi più vecchi di microscopi senza lenti che producono un’immagine d’ombra proiettata.
Proiettori autoelettronici e autoionici. La sorgente elettronica di campo utilizzata nell'RPEM è stata utilizzata nei proiettori d'ombra sin dall'inizio degli anni '50. In un proiettore a emissione di campo, gli elettroni emessi per emissione di campo da una punta di diametro molto piccolo vengono accelerati verso uno schermo fluorescente situato a pochi centimetri dalla punta. Di conseguenza, sullo schermo appare un'immagine proiettata della superficie della punta e delle particelle situate su questa superficie con un aumento pari al rapporto tra il raggio dello schermo e il raggio della punta (ordine). Una risoluzione più elevata si ottiene in un proiettore di ioni di campo, in cui l'immagine viene proiettata utilizzando ioni di elio (o altri elementi), la cui lunghezza d'onda effettiva è inferiore a quella degli elettroni. Ciò produce immagini che mostrano la vera disposizione degli atomi nel reticolo cristallino del materiale della punta. Pertanto, i proiettori di ioni di campo vengono utilizzati, in particolare, per studiare la struttura cristallina e i suoi difetti nei materiali con cui possono essere realizzate tali punte.
Microscopio a effetto tunnel (RTM). Questo microscopio utilizza anche una punta metallica di piccolo diametro per fornire elettroni. Nello spazio tra la punta e la superficie del campione viene creato un campo elettrico. Il numero di elettroni attirati dal campo dalla punta per unità di tempo (corrente di tunneling) dipende dalla distanza tra la punta e la superficie del campione (in pratica, questa distanza è inferiore a 1 nm). Man mano che la punta si muove lungo la superficie, la corrente viene modulata. Ciò consente di ottenere un'immagine relativa alla topografia superficiale del campione. Se la punta termina con un singolo atomo, è possibile formare un'immagine della superficie passando atomo per atomo. L'RTM può funzionare solo se la distanza dalla punta alla superficie è costante e la punta può essere spostata con precisione atomica. Le vibrazioni vengono soppresse grazie al design rigido e alle dimensioni ridotte del microscopio (non più grande di un pugno), nonché all'uso di ammortizzatori in gomma multistrato. L'elevata precisione è garantita dai materiali piezoelettrici, che si allungano e si contraggono sotto l'influenza di un campo elettrico esterno. Applicando una tensione dell'ordine di 10-5 V, è possibile modificare le dimensioni di tali materiali di 0,1 nm o meno. Ciò consente, fissando la punta ad un elemento in materiale piezoelettrico, di spostarla in tre direzioni reciprocamente perpendicolari con una precisione dell'ordine delle dimensioni atomiche.
TECNICA DELLA MICROSCOPIA ELETTRONICA
Non c'è quasi nessun settore di ricerca nel campo della biologia e della scienza dei materiali che non utilizzi la microscopia elettronica a trasmissione (TEM); ciò è garantito dai progressi nelle tecniche di preparazione dei campioni. Tutte le tecniche utilizzate nella microscopia elettronica mirano ad ottenere un campione estremamente sottile e fornire il massimo contrasto tra esso e il substrato di cui necessita come supporto. La tecnica di base è progettata per campioni con uno spessore di 2-200 nm, supportati da sottili pellicole di plastica o carbonio, che vengono posizionate su una griglia con una dimensione delle maglie di ca. 0,05 mm. ( Campione adatto, non importa come ottenuto, viene elaborato in modo da aumentare l'intensità della diffusione degli elettroni sull'oggetto in esame.) Se il contrasto è sufficientemente elevato, l'occhio dell'osservatore può, senza sforzo, distinguere i dettagli situati a una distanza di 0,1 -0,2 mm l'uno dall'altro. Di conseguenza, affinché nell'immagine creata da un microscopio elettronico siano distinguibili i dettagli separati da una distanza di 1 nm sul campione, è necessario un ingrandimento totale dell'ordine di 100-200 mila. I migliori microscopi possono creare un'immagine di un campione su una lastra fotografica con un tale ingrandimento, ma allo stesso tempo L'area mostrata è troppo piccola. Tipicamente una micrografia viene scattata con un ingrandimento inferiore e poi ingrandita fotograficamente. La lastra fotografica risolve ca. 10.000 righe. Se ciascuna linea sul campione corrisponde ad una determinata struttura con una lunghezza di 0,5 nm, per registrare tale struttura è necessario un ingrandimento di almeno 20.000, mentre con l'aiuto di SEM e RPEM, in cui viene registrata l'immagine sistema elettronico e si apre sullo schermo televisivo, si risolve solo ca. 1000 righe. Pertanto, quando si utilizza un monitor televisivo, l'ingrandimento minimo richiesto è circa 10 volte maggiore rispetto a quando si fotografa.
Farmaci biologici. La microscopia elettronica è ampiamente utilizzata nella ricerca biologica e medica. Sono stati sviluppati metodi per la fissazione, l'inclusione e l'ottenimento di sezioni sottili di tessuto per l'esame in OPEM e RPEM, nonché tecniche di fissazione per l'esame di campioni volumetrici in SEM. Queste tecniche permettono di studiare l'organizzazione cellulare a livello macromolecolare. La microscopia elettronica ha rivelato i componenti della cellula e i dettagli strutturali delle membrane, dei mitocondri, del reticolo endoplasmatico, dei ribosomi e di molti altri organelli che compongono la cellula. Il campione viene prima fissato con glutaraldeide o altri fissativi e poi disidratato e incorporato nella plastica. I metodi di criofissazione (fissazione a temperature molto basse - criogeniche -) consentono di preservare la struttura e la composizione senza l'uso di sostanze chimiche fissanti. Inoltre, i metodi criogenici consentono l'imaging di campioni biologici congelati senza disidratazione. Utilizzando ultramicrotomi con lame di diamante lucidato o vetro scheggiato, si possono realizzare sezioni di tessuto con uno spessore di 30-40 nm. I preparati istologici montati possono essere colorati con composti di metalli pesanti (piombo, osmio, oro, tungsteno, uranio) per aumentare il contrasto dei singoli componenti o strutture.
La ricerca biologica è stata estesa ai microrganismi, in particolare ai virus, che non vengono risolti dai microscopi ottici. Il TEM ha permesso di rivelare, ad esempio, le strutture dei batteriofagi e la posizione delle subunità negli involucri proteici dei virus. Inoltre, utilizzando metodi di colorazione positiva e negativa, è stato possibile identificare la struttura con subunità in una serie di altre importanti microstrutture biologiche. Le tecniche di potenziamento del contrasto degli acidi nucleici hanno reso possibile l'osservazione del DNA a singolo e doppio filamento. Queste lunghe molecole lineari sono distribuite in uno strato di proteine basiche e applicate su una pellicola sottile. Uno strato molto sottile viene quindi applicato al campione mediante deposizione sotto vuoto. metallo pesante. Questo strato di metallo pesante “ombreggia” il campione, per cui quest'ultimo, se osservato in OPEM o RPEM, appare come illuminato dal lato da cui è stato depositato il metallo. Se si ruota il campione durante la deposizione, il metallo si accumula attorno alle particelle su tutti i lati in modo uniforme (come una palla di neve).
Materiali non biologici. Il TEM viene utilizzato nella ricerca sui materiali per studiare i cristalli sottili e i confini tra diversi materiali. Per ottenere un'immagine ad alta risoluzione dell'interfaccia, il campione viene riempito di plastica, il campione viene tagliato perpendicolarmente all'interfaccia e quindi assottigliato in modo che l'interfaccia sia visibile con un bordo netto. Il reticolo cristallino disperde fortemente gli elettroni in determinate direzioni, producendo una figura di diffrazione. L'immagine di un campione cristallino è in gran parte determinata da questo schema; il contrasto dipende fortemente dall'orientamento, dallo spessore e dalla perfezione del reticolo cristallino. I cambiamenti di contrasto nell'immagine permettono di studiare il reticolo cristallino e le sue imperfezioni su scala atomica. Le informazioni ottenute in questo caso integrano quelle fornite dall'analisi a raggi X di campioni sfusi, poiché l'EM consente di vedere direttamente dislocazioni, difetti di impilamento e bordi di grano in tutti i dettagli. Inoltre, è possibile acquisire modelli di diffrazione elettronica utilizzando EM e osservare modelli di diffrazione da aree selezionate del campione. Se l'apertura dell'obiettivo viene regolata in modo che solo un raggio centrale diffratto e non diffuso lo attraversi, è possibile ottenere un'immagine un certo sistema piani di cristallo, che danno questo raggio diffratto. Gli strumenti moderni consentono di risolvere periodi reticolari di 0,1 nm. I cristalli possono anche essere studiati utilizzando l'imaging in campo scuro, in cui il raggio centrale è bloccato in modo che l'immagine sia formata da uno o più raggi diffratti. Tutti questi metodi hanno fornito informazioni importanti sulla struttura di molti materiali e hanno chiarito in modo significativo la fisica dei cristalli e le loro proprietà. Ad esempio, l'analisi delle immagini TEM del reticolo cristallino di quasicristalli sottili di piccole dimensioni in combinazione con l'analisi dei loro schemi di diffrazione elettronica ha reso possibile nel 1985 la scoperta di materiali con simmetria del quinto ordine.
Microscopia ad alta tensione. Attualmente, l'industria produce versioni ad alta tensione di OPEM e RPEM con una tensione di accelerazione da 300 a 400 kV. Tali microscopi hanno un potere di penetrazione maggiore rispetto ai dispositivi a bassa tensione e in questo senso sono quasi altrettanto efficienti dei microscopi da 1 milione di volt costruiti in passato. I moderni microscopi ad alta tensione sono abbastanza compatti e possono essere installati in un normale laboratorio. Il loro maggiore potere penetrante si rivela una proprietà molto preziosa quando si studiano i difetti nei cristalli più spessi, specialmente quelli dai quali è impossibile ricavare campioni sottili. In biologia, la loro elevata capacità di penetrazione permette di studiare cellule intere senza tagliarle. Inoltre, con l'aiuto di tali microscopi è possibile ottenere immagini tridimensionali di oggetti spessi.
Microscopia a bassa tensione. Sono disponibili anche SEM con tensioni di accelerazione di poche centinaia di volt. Anche a tensioni così basse la lunghezza d'onda degli elettroni è inferiore a 0,1 nm, quindi anche qui la risoluzione spaziale è limitata dalle aberrazioni delle lenti magnetiche. Tuttavia, poiché gli elettroni con un’energia così bassa penetrano poco sotto la superficie del campione, quasi tutti gli elettroni coinvolti nella formazione dell’immagine provengono da una regione situata molto vicino alla superficie, aumentando così la risoluzione del rilievo superficiale. Utilizzando SEM a bassa tensione, sono state ottenute immagini su superfici solide di oggetti più piccoli di 1 nm.
Danni da radiazioni. Poiché gli elettroni sono radiazioni ionizzanti, il campione nell'EM è costantemente esposto ad esse. (Questa esposizione produce elettroni secondari utilizzati nel SEM.) Di conseguenza, i campioni sono sempre soggetti a danni da radiazioni. La dose tipica di radiazione assorbita da un campione sottile durante la registrazione di una microfotografia in un OPEM corrisponde approssimativamente all'energia che sarebbe sufficiente per far evaporare completamente l'acqua fredda da uno stagno profondo 4 m con una superficie di 1 ettaro. Per ridurre il danno da radiazioni a un campione, è necessario utilizzare vari metodi di preparazione del campione: colorazione, inclusione, congelamento. Inoltre, è possibile registrare un'immagine con dosi di elettroni 100-1000 volte inferiori rispetto alla tecnica standard e quindi migliorarla utilizzando metodi di elaborazione delle immagini al computer.
BACKGROUND STORICO
La storia della creazione del microscopio elettronico è un meraviglioso esempio di come campi della scienza e della tecnologia che si sviluppano in modo indipendente possano, scambiando le informazioni ricevute e unendo le forze, creare un nuovo strumento potente ricerca scientifica. L'apice della fisica classica era la teoria del campo elettromagnetico, che spiegava la propagazione della luce, la comparsa di campi elettrici e magnetici e il movimento delle particelle cariche in questi campi come propagazione delle onde elettromagnetiche. L'ottica ondulatoria ha chiarito il fenomeno della diffrazione, il meccanismo di formazione dell'immagine e il gioco dei fattori che determinano la risoluzione nel microscopio ottico. Successo nel campo della teoria e fisica sperimentale dobbiamo la scoperta dell'elettrone con le sue proprietà specifiche. Questi percorsi di sviluppo separati e apparentemente indipendenti portarono alla fondazione dell'ottica elettronica, una delle applicazioni più importanti della quale fu l'invenzione dell'EM negli anni '30. Un indizio diretto di questa possibilità può essere considerato l'ipotesi sulla natura ondulatoria dell'elettrone, avanzata nel 1924 da Louis de Broglie e confermata sperimentalmente nel 1927 da K. Davisson e L. Germer negli Stati Uniti e J. Thomson in Inghilterra. Ciò ha suggerito un'analogia che ha permesso di costruire un EM secondo le leggi dell'ottica ondulatoria. H. Bush scoprì che utilizzando i campi elettrici e magnetici è possibile formare immagini elettroniche. Nei primi due decenni del XX secolo. sono stati inoltre creati i necessari presupposti tecnici. I laboratori industriali che lavorano sull'oscilloscopio a fascio di elettroni hanno prodotto la tecnologia del vuoto, fonti stabili di alta tensione e corrente e buoni emettitori di elettroni. Nel 1931, R. Rudenberg depositò una domanda di brevetto per un microscopio elettronico a trasmissione e nel 1932 M. Knoll ed E. Ruska costruirono il primo microscopio di questo tipo, utilizzando lenti magnetiche per focalizzare gli elettroni. Questo dispositivo era il predecessore del moderno OPEM. (Ruska fu ricompensato per i suoi sforzi vincendo il Premio Nobel per la fisica nel 1986.) Nel 1938, Ruska e B. von Borries costruirono un prototipo di OPEM industriale per Siemens-Halske in Germania; questo strumento ha permesso infine di raggiungere una risoluzione di 100 nm. Alcuni anni dopo, A. Prebus e J. Hiller costruirono il primo OPEM ad alta risoluzione presso l'Università di Toronto (Canada). Le ampie possibilità dell’OPEM divennero quasi immediatamente evidenti. Il suo produzione industrialeè stato avviato contemporaneamente dalla Siemens-Halske in Germania e dalla RCA Corporation negli Stati Uniti. Alla fine degli anni Quaranta altre aziende iniziarono a produrre tali dispositivi. Il SEM nella sua forma attuale fu inventato nel 1952 da Charles Otley. È vero, versioni preliminari di un simile dispositivo furono costruite da Knoll in Germania negli anni '30 e da Zworykin e i suoi colleghi alla RCA Corporation negli anni '40, ma solo il dispositivo di Otley fu in grado di servire come base per una serie di miglioramenti tecnici, culminati con l'introduzione nella produzione di una versione industriale del SEM a metà degli anni '60. La gamma di consumatori di un dispositivo così facile da usare con un'immagine tridimensionale e un segnale di uscita elettronico si è ampliata in modo esponenziale. Attualmente, ci sono una dozzina di produttori industriali di SEM in tre continenti e decine di migliaia di dispositivi simili utilizzati nei laboratori di tutto il mondo. Negli anni '60 furono sviluppati microscopi ad altissima tensione per studiare campioni più spessi Lo sviluppo fu G. Dupuy in Francia, dove nel 1970 fu introdotto un dispositivo con una tensione di accelerazione di 3,5 milioni di volt RTM fu inventato da G. Binnig e G. Rohrer nel 1979 a Zurigo Questo dispositivo, molto semplice design, fornisce la risoluzione atomica delle superfici Per la creazione di RTM, Binnig e Rohrer (contemporaneamente a Ruska) hanno ricevuto il Premio Nobel per la fisica.
Vedi anche
CRISTALLI E CRISTALLOGRAFIA;
STRUTTURA MOLECOLARE;
ACIDI NUCLEICI;
FISICA DELLO STATO SOLIDO;
VIRUS.
LETTERATURA
Polyankevich A.N. Microscopi elettronici. Kiev, 1976 Spence J. Microscopia ionica sperimentale ad alta risoluzione. M., 1986
Enciclopedia di Collier. - Società aperta. 2000 .
Per studiare i nanooggetti, la risoluzione dei microscopi ottici ( anche utilizzando l'ultravioletto) chiaramente non è sufficiente. A questo proposito, negli anni '30. È nata l'idea di utilizzare gli elettroni al posto della luce, la cui lunghezza d'onda, come sappiamo dalla fisica quantistica, è centinaia di volte inferiore a quella dei fotoni.
Come sapete, la nostra visione si basa sulla formazione dell'immagine di un oggetto sulla retina dell'occhio mediante onde luminose riflesse da questo oggetto. Se la luce passa attraverso un sistema ottico prima di entrare nell'occhio microscopio, vediamo un'immagine ingrandita. In questo caso, il percorso dei raggi luminosi è abilmente controllato dalle lenti che compongono l'obiettivo e l'oculare del dispositivo.
Ma come si può ottenere l'immagine di un oggetto, e con una risoluzione molto più elevata, utilizzando non la radiazione luminosa, ma un flusso di elettroni? In altre parole, come è possibile vedere gli oggetti utilizzando particelle invece che onde?
La risposta è molto semplice. È noto che la traiettoria e la velocità degli elettroni sono influenzate in modo significativo dai campi elettromagnetici esterni, con l'aiuto dei quali è possibile controllare efficacemente il movimento degli elettroni.
Si chiama la scienza del movimento degli elettroni nei campi elettromagnetici e il calcolo dei dispositivi che formano i campi necessari ottica elettronica.
Un'immagine elettronica è formata da campi elettrici e magnetici più o meno allo stesso modo in cui un'immagine luminosa è formata da lenti ottiche. Pertanto, in un microscopio elettronico, i dispositivi per focalizzare e diffondere un fascio di elettroni sono chiamati “ lenti elettroniche”.
Obiettivo elettronico. Le bobine di fili percorsi da corrente focalizzano il fascio di elettroni nello stesso modo in cui una lente di vetro focalizza un raggio di luce.
Il campo magnetico della bobina agisce come una lente convergente o divergente. Per concentrare il campo magnetico, la bobina è ricoperta da un "magnetico" armatura» realizzato in una speciale lega di nichel-cobalto, lasciando solo uno stretto spazio nella parte interna. Il campo magnetico creato in questo modo può essere 10-100mila volte più forte del campo magnetico terrestre!
Sfortunatamente, i nostri occhi non possono percepire direttamente i fasci di elettroni. Pertanto vengono utilizzati per “ disegno" immagini su schermi fluorescenti (che si illuminano quando colpiti dagli elettroni). A proposito, lo stesso principio è alla base del funzionamento di monitor e oscilloscopi.
Ce ne sono molti diversi tipi di microscopi elettronici, tra cui il più diffuso è il microscopio elettronico a scansione (SEM). Ne otterremo lo schema semplificato se posizioniamo l'oggetto in studio all'interno del tubo catodico di un normale televisore tra lo schermo e la sorgente di elettroni.
In questo microscopio un sottile fascio di elettroni (diametro del fascio circa 10 nm) gira attorno (come se scansionasse) il campione lungo linee orizzontali, punto per punto, e trasmette in modo sincrono il segnale al cinescopio. L'intero processo è simile al funzionamento di un televisore durante il processo di scansione. La sorgente di elettroni è un metallo (solitamente tungsteno), dal quale vengono emessi elettroni quando riscaldato a causa dell'emissione termoionica.
Schema di funzionamento di un microscopio elettronico a scansione
Emissione termoionica– rilascio di elettroni dalla superficie dei conduttori. Il numero di elettroni rilasciati è piccolo a T=300K e aumenta esponenzialmente con l'aumentare della temperatura.
Quando gli elettroni passano attraverso un campione, alcuni di essi vengono dispersi a causa delle collisioni con i nuclei degli atomi del campione, altri vengono dispersi a causa delle collisioni con gli elettroni degli atomi e altri ancora lo attraversano. In alcuni casi vengono emessi elettroni secondari, viene indotta radiazione di raggi X, ecc. Tutti questi processi sono registrati da speciali rilevatori e in forma convertita vengono visualizzati sullo schermo, creando un'immagine ingrandita dell'oggetto studiato.
L'ingrandimento in questo caso è inteso come il rapporto tra la dimensione dell'immagine sullo schermo e la dimensione dell'area coperta dal raggio sul campione. Poiché la lunghezza d'onda di un elettrone è di ordini di grandezza inferiore a quella di un fotone, nei moderni SEM questo ingrandimento può raggiungere i 10 milioni15, corrispondente a una risoluzione di pochi nanometri, che rende possibile visualizzare i singoli atomi.
Principale svantaggio microscopia elettronica– la necessità di lavorare in completo vuoto, perché la presenza di qualsiasi gas all’interno della camera del microscopio può portare alla ionizzazione dei suoi atomi e distorcere notevolmente i risultati. Inoltre, gli elettroni hanno un effetto distruttivo sugli oggetti biologici, il che li rende inutilizzabili per la ricerca in molti settori della biotecnologia.
Storia della creazione microscopio elettronicoè un notevole esempio di risultato basato su un approccio interdisciplinare, quando campi della scienza e della tecnologia che si sviluppano in modo indipendente si sono uniti per creare un nuovo potente strumento per la ricerca scientifica.
L'apice della fisica classica era la teoria del campo elettromagnetico, che spiegava la propagazione della luce, dell'elettricità e del magnetismo come propagazione delle onde elettromagnetiche. L'ottica ondulatoria ha spiegato il fenomeno della diffrazione, il meccanismo di formazione dell'immagine e il gioco dei fattori che determinano la risoluzione in un microscopio ottico. Successo fisica quantistica a noi si deve la scoperta dell'elettrone con le sue specifiche proprietà onda-particella. Questi percorsi di sviluppo separati e apparentemente indipendenti portarono alla creazione dell'ottica elettronica, una delle invenzioni più importanti della quale fu il microscopio elettronico negli anni '30.
Ma anche su questo gli scienziati non si sono fermati. La lunghezza d'onda di un elettrone accelerato da un campo elettrico è di diversi nanometri. Questo non è male se vogliamo vedere una molecola o anche un reticolo atomico. Ma come guardare all'interno di un atomo? Com'è un legame chimico? Come si presenta il processo di una singola reazione chimica? Per questo oggi in diversi paesi gli scienziati stanno sviluppando microscopi a neutroni.
I neutroni di solito fanno parte dei nuclei atomici insieme ai protoni e hanno una massa quasi 2000 volte maggiore di un elettrone. Chi non ha dimenticato la formula di de Broglie del capitolo quantistico si renderà subito conto che la lunghezza d'onda di un neutrone è altrettante volte più corta, cioè è picometro, millesimi di nanometro! Allora l'atomo apparirà ai ricercatori non come un granello sfocato, ma in tutto il suo splendore.
Neutrone microscopio presenta molti vantaggi: in particolare, i neutroni mappano bene gli atomi di idrogeno e penetrano facilmente strati spessi di campioni. Tuttavia, è anche molto difficile da costruire: i neutroni non hanno carica elettrica, quindi ignorano facilmente i campi magnetici ed elettrici e cercano di eludere i sensori. Inoltre, non è così facile espellere neutroni grandi e goffi dagli atomi. Pertanto, oggi i primi prototipi di un microscopio a neutroni sono ancora molto lontani dall'essere perfetti.
Cos'è un microscopio USB?
Un microscopio USB è un tipo di microscopio digitale. Invece del solito oculare, qui è installata una fotocamera digitale, che cattura l'immagine dall'obiettivo e la trasferisce sullo schermo del monitor o del laptop. Questo microscopio si collega al computer in modo molto semplice – tramite un normale cavo USB. Il microscopio viene sempre fornito con un software speciale che consente di elaborare le immagini risultanti. Puoi scattare foto, creare video, modificare il contrasto, la luminosità e le dimensioni dell'immagine. Possibilità software dipendono dal produttore.
Un microscopio USB è principalmente un dispositivo di ingrandimento compatto. È comodo da portare con sé in viaggio, ai meeting o fuori città. Di solito, un microscopio USB non vanta un ingrandimento elevato, ma per studiare monete, caratteri piccoli, oggetti d'arte, campioni di tessuto o banconote, le sue capacità sono abbastanza sufficienti. Con l'aiuto di un microscopio di questo tipo puoi esaminare piante, insetti e piccoli oggetti intorno a te.
Dove acquistare un microscopio elettronico?
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Stiamo iniziando a pubblicare il blog di un imprenditore, specialista del settore tecnologie dell'informazione e il designer amatoriale part-time Alexey Bragin, che racconta un'esperienza insolita: ormai da un anno l'autore del blog è impegnato a restaurare complesse apparecchiature scientifiche - un microscopio elettronico a scansione - praticamente a casa. Leggi cosa sia l'ingegneria, la tecnica e compiti scientifici Alexey ha dovuto affrontare e come li ha affrontati.
Un giorno un amico mi ha chiamato e mi ha detto: ho trovato una cosa interessante, devo portartela, ma pesa mezza tonnellata. Ecco come è apparsa nel mio garage una colonna di un microscopio elettronico a scansione JEOL JSM-50A. È stato cancellato molto tempo fa da qualche istituto di ricerca e portato tra i rottami metallici. L'elettronica andò perduta, ma la colonna elettro-ottica, insieme alla parte del vuoto, fu salvata.
Poiché la parte principale dell'attrezzatura è stata preservata, è sorta la domanda: è possibile salvare l'intero microscopio, cioè ripristinarlo e riportarlo in condizioni di lavoro? E proprio in garage, con le tue mani, utilizzando solo le conoscenze ingegneristiche di base e gli strumenti disponibili? È vero, non avevo mai avuto a che fare con un'attrezzatura scientifica del genere prima, per non parlare di come usarla, e non avevo idea di come funzionasse. Ma è interessante non solo mettere in funzione il vecchio componente hardware, è interessante capirlo da soli e verificare se è possibile utilizzare metodo scientifico, esplorare aree completamente nuove. Così ho cominciato a restaurare un microscopio elettronico in garage.
In questo blog ti racconterò cosa sono già riuscito a fare e cosa resta da fare. Lungo il percorso ti presenterò i principi di funzionamento dei microscopi elettronici e i loro componenti principali e ti parlerò anche dei numerosi ostacoli tecnici che hanno dovuto essere superati lungo il percorso. Quindi cominciamo.
Per riportare il microscopio almeno allo stato “disegniamo con un fascio di elettroni su uno schermo fluorescente”, era necessario quanto segue:
Cominciamo in ordine. Oggi parlerò dei principi di funzionamento dei microscopi elettronici. Sono di due tipi:
Microscopio elettronico a trasmissione
Il TEM è molto simile a un microscopio ottico convenzionale, solo che il campione in esame viene irradiato non con luce (fotoni), ma con elettroni. La lunghezza d'onda del fascio di elettroni è molto più corta di quella del fascio di fotoni, quindi è possibile ottenere una risoluzione notevolmente maggiore.
Il fascio di elettroni viene focalizzato e controllato utilizzando lenti elettromagnetiche o elettrostatiche. Presentano addirittura le stesse distorsioni (aberrazioni cromatiche) delle lenti ottiche, sebbene la natura dell'interazione fisica sia completamente diversa. A proposito, aggiunge anche nuove distorsioni (causate dalla torsione degli elettroni nella lente lungo l'asse del fascio di elettroni, cosa che non accade con i fotoni in un microscopio ottico).
Il TEM presenta degli svantaggi: i campioni oggetto di studio devono essere molto sottili, più sottili di 1 micron, cosa non sempre conveniente, soprattutto quando si lavora a casa. Ad esempio, per vedere i capelli attraverso la luce, è necessario tagliarli longitudinalmente in almeno 50 strati. Ciò è dovuto al fatto che il potere di penetrazione del fascio di elettroni è molto peggiore di quello del fascio di fotoni. Inoltre, i FEM, salvo rare eccezioni, sono piuttosto macchinosi. Questo dispositivo, mostrato sotto, non sembra essere così grande (anche se è più alto dell'altezza umana e ha un solido telaio in ghisa), ma è dotato anche di un alimentatore delle dimensioni di un grande armadio - in totale, quasi è necessaria un'intera stanza.
Ma TEM ha la risoluzione più alta. Con il suo aiuto (se ci provi) puoi vedere i singoli atomi di una sostanza.
Università di Calgary
Questa risoluzione può essere particolarmente utile per identificare l'agente eziologico di una malattia virale. Tutte le analisi dei virus del 20° secolo sono state costruite sulla base dei TEM e solo con l'avvento di metodi più economici per diagnosticare i virus più diffusi (ad esempio, la reazione a catena della polimerasi o PCR) l'uso di routine dei TEM per questo scopo è cessato.
Ecco ad esempio come appare “alla luce” l’influenza H1N1:
Università di Calgary
Microscopio elettronico a scansione
Il SEM viene utilizzato principalmente per esaminare la superficie dei campioni con una risoluzione molto elevata (un ingrandimento di un milione di volte, contro 2mila per i microscopi ottici). E questo è molto più utile in casa :)
Ad esempio, ecco come appare una singola setola su un nuovo spazzolino da denti:
La stessa cosa dovrebbe accadere nella colonna ottico-elettronica di un microscopio, solo che qui viene irradiato il campione, non il fosforo dello schermo, e l'immagine si forma sulla base delle informazioni provenienti da sensori che registrano elettroni secondari, elettroni riflessi elasticamente, ecc. Questo è il tipo di microscopio elettronico di cui parleremo in questo blog.
Sia il tubo catodico televisivo che la colonna ottico-elettronica del microscopio funzionano solo sotto vuoto. Ma di questo parlerò in dettaglio nel prossimo numero.
(Continua)
